农业农村部公告第628号-11-2022 转基因植物及其产品成分检测 水稻常见转基因成分筛查.pdf

ICS65020.0CCSB04中华人民共禾口国国家标准农业农村部公吉第628号2022转基因植物及其产品成分检测水稻常见转基因成分筛查DetectionofgeneticalymodifiedplantsandderivedproductsScreeningofcomnongenetica!ymodifiedcomponentsinrice2023030实施2022-29发布【x一么qI尸中华人民共和国农业农村部发布农业农村部公告第628号2022一刚-口本文件按照GBT1.1-2（）20标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发j机构不承担识别专利的责任本文件由中华人民共和国农业农村部提出本文件由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口本文件起草单位:农业农村部科技发展中心、安徽省农业科学院水稻研究所本文件主要起草人:马卉、张秀杰、汪秀峰、陈子言、许学梁晋刚、王颖潜、吴爽、潘伟芹、焦小雨农业农村部公告第628号-2022转基因植物及其产品成分检测水稻常见转基因成分筛查范围本文件规定了水稻中常见转基因成分的定性筛查方法动队子2:,本仅文333333b.基因bialaphosresistancegene来源于士壤吸水链霉菌（St户o）OceUg厂oNco加c!）,编码臃丝菌索乙酞转移酶（phosphinothrlcnacetyltranserasePAT）。3.6HPT基因hygromycinphosphotransferasegene来源于大肠杆菌或链球菌（S厂1oDc“Dg肘coc“）,编码潮霉索磷酸转移酶（hygromyclnphosphoranserase,HPT）的基因4原理依据12种转基因水稻转化体中常见的5种调控元件和基因序列,设计特异性引物及探针对试样进衔农业农村部公告第628号-2022PCR扩增依据是否扩增获得预期的DNA片段或典型扩增曲线,判断样品中是否含有相应的转基因成分5试剂和材料除非另有说明,仅使用分析纯试剂和重蒸馏水5琼脂糖5.210gL澳化乙锭（EB）溶液:称取10g澳化乙锭,溶解于100mL水中避光保存警告涅化乙锭有致癌作用配制和使用时应戴次性手套操作并妥善处理废弃物。注:根据需耍可选择其他效果相当的核酸染料代替嗅化乙锭作为核酸电泳的染色剂5.310molL氢氧化钠（NaOH）溶液:在160mL水中人80.0g氢氧化钠溶解后冷却至室温再加水定容至200mL5.500mmolL乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）溶液（pH8.0）:称取18.6g乙二胺四乙酸二钠,j人70mL水中缓慢滴加氢氧化钠溶液（见5.3）直至EDTANa2完全溶解用氢氧化钠溶液（见5.3）调pH至8.0,水定容至100mL在103.4kPa（121）条件下灭菌20min5.51molL三轻甲基氨基甲烷盐酸（TrisHCl）溶液（pH8.0）:称取121.1g三轻甲基氨基甲烷溶解于800mL水中用盐酸调pH至8.0,加水定容至1000mL在103.4kPa（121）条件下灭菌20min5.6TE缓）液（pH8.0）:分别量取10mL三轻甲基氨基甲烷盐酸溶液（见5.5）和2mL乙二胺四乙酸二钠溶液（见5.4）加水定容至1000mL在103.4kPa（121）条件下灭菌20mjn5.750TAE缓液:称取242.2g三轻甲基氨基甲烷（Tris）先用500mL水热搅拌溶解后人00mL乙二胺四乙酸二钠溶液（见5.4）用冰乙酸调pH至8.0,然后加水定容至1000mL使用时用水稀释成1TAE58加样缓冲液:称取250.0mg漠酚蓝加人10mL水在室温下溶解12h;称取250.0mg二甲基苯腊腋,加10mL水溶解;称取50.0g蔗糖加30mL水溶解混合以上3种溶液,川水定容至100mL,在4下保存59DNA分子量标准:可以清楚区分100bp1000bp的DNA片段。50dNTPs混合溶液:将浓度为10mmolL的dATP、dTTP、dGTP、dCTP4种脱氧核糖核昔酸溶液等体积混合5.mqDNA聚合酶、PCR扩增缓!液及25mmolL氯化镁（MgCl2）溶液52普通PCR方法引物检测参数的普通PCR方法弓物序列及目的片段大小见表1表普通PCR方法引物组合信息表检测参数引物序列（53）ATCTGTTTACTCGTCAAGTGTCATCTCGCCATGGATTACATATGGCAAGAGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCAACACTGGCAAGTTAGCAATCCGTATAAATAGACACCCGAATCCTGTTGCCGGTCTTGTATCClAGTTTGCGCGCTAACAAGCACGGTCAACTTCCACTCGGCCGTCCAGTCGTAGAAGTGCT、GACATTGGGGGTAGATGllGGCGACCTCGTATT目的片段大小bpSps尸FspsRSPS赋因287PCaMV35SFPCaMV35SRPubiFPubiRTNOSFTNOSRba广FbarRhP1Fhp1RO!MV35S启动子95顺q!启动子l4VOS终子802206厂某因l75HPT雌阀72注:NOS终止子引物组合在TlOl9和T2A中的扩增产物片段大小为220bp,在其他l0种转苯因水稻转化体中扩增产物片段大小为l80bp。2农业农村部公告第628号-202253实时荧光PCR方法引物和探针检测参数的实时荧光PCR方法引物探针序列及目的片段大小见表2,探针5端标记荧光报告基（如FAM、HEX等）3端标记对应的淬灭基团（如TAMRA、BHQ1等）。表2实时荧光PCR方法弓物和探针组合信息表序列（53）.门GCGCCTGAACGGATATC（TGATCTTTTCGG（TGTCCGAGCCGTCCGTjCGTC的片段大小,p检测参数引物探针SpSqF门sPsqRC（SpS尸qPTCPCaMV35SqF一PCaMV35SqRPCaMV35SqP厂山厂一谜Pubiq、OAdl芋-纠x懈霹屈葵）S懈急隅墨鱼恤m厂、oAdT8SPS娥因甲二G淫ChMV35S启动子7色坠兰A哩诬生MQ醉咀3J网kUbjq!启动子26趣瞬剪娜鹏辑65205M乃终止子h匿漫涵睡6撼因75蓝1恭霞壤i-四j攫if嚣鸵i疆辱腿蔼鞭HPT某因0坐体化转稻水团基广纠注:NoS终止中扩增产.I胃5555554567896主66.2636.4电泳槽、电泳仪等电泳装置6.5凝胶成像系统或照相系统7操作步骤7.抽样按NYT672和农业部2031号公告192013的规定执行。7.2试样制备按NYT672利农业部2031号公告192013的规定执行7.3试样预处理按农业部1485号公告-42010的规定执行3农业农村部公告第628号-20227.4DNA模板制备按农业部1485号公告42010的规定执行。7.5PCR扩增7.5普通PCR方法75川试样PcR扩增7.5.每个试样PCR扩增设置3个平行75.2按表3依次加人反应试剂混匀,分装到PCR管中,再加25队L石蜡油（有热盖功能的PCR仪可不加）也可采用经验证的、效果相当的定性PCR试剂盒配制反应体系表3普通PCR扩增体系试剂ddH2Ol0PCR缓冲液25mmoI.氯化镁溶液dNTPs混合溶液（各2.5mmolL）l0似moL上游引物0么molI.下游引物qINA聚合酶25mgIDNA模板总体积终浓度体积2。5Ll.5队L20严Ll0似L1.0队L2.0仪L250件I.l.5mmolL0.2mmolI0.4严molI0。4似molI.0.025U件L2.0mgL“”表示体积不确定.如果PCR缓冲液中含有轧化镁,则不加氯化镁溶液根据Thq酶的浓度确定其体积,并相应调整dd卜l留O的体积,使反应体系总体积达到25.0队L若采附定性PCR试剂盒,则按试剂盒说明书的推荐用敞配制反应体系,但上下游引物用斌按表3执行75,3将PCR管放在离心机上,500g3000g离心10s然后取出PCR管放人PCR仪中7.5.进行PCR扩增。反应程序为:94变性5min;94变性30s58退火30S,72延伸3（）s,共进行35次循环;72延伸7min;10保存7,5.5反应结束后取出PCR管,对PCR扩增产物进行电泳检测。7.5.2对照PCR扩增在试样PCR扩增的同时,应设置PCR阳性对照、PCR阴性对照利PCR空白对照以含有对应调控元件或基因的质量分数为011.0的水稻基因组DNA（或采用对应调控元件或基因与非转基因水稻基因组相比拷贝数分数为0.11.0的DNA溶液）为阳性对照;以非转基因水稻基囚组DNA作为阴性对照;以水作为空白对照除模板外对照PCR扩增与试样PCR扩增相同（见7.5.1.1）7.5.3PCR产物电泳检测按20gL的质量浓度称量琼脂糖,加人1TAE缓冲液中加热溶解配制成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加人5似LEB溶液或适量的其他核酸染料,混匀,稍适冷却后将其倒人电泳板上插上梳板,室温下凝固成凝胶后,放人lTAE缓枷液中,垂直向二轻轻拔去梳板取12队LPCR产物与3队L加样缓）液混合后加人凝胶点样孔同时在其中-个点样孔中加人DNA分子量标准接通电源在2Vcm5Vcm条件下电泳检测7.54凝胶成像分析电泳结束后取出琼脂糖凝胶,置于凝胶成像仪上成像根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照如需通过序列分析确认PCR扩增片段是否为目的DN片段,按照7.5.15和7.5.1.6的规定执行75.5PCR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书,回收PCR扩增的DNA片段7.5.6PCR产物测序验证4农业农村部公告第628号-2022将回收的PCR产物测序,与对应调控元件或基囚的序列（见附录B）进行比对,确定PCR扩增的I）NA片段是否为目的DNA片段7.5.2实时荧光PCR方法7.5.2.试样PCR扩增7.5.2.每个试样PCR扩增设置3个平行75.22按表4依次加人反应试剂,混匀,分装到pcR管中也可采用经验证的、效果相当的实时荧光PCR试剂盒配制反应体系表q实时荧光PCR扩增体系体积20严L2,0队Ll6L08仪L08似L0.8似L2.0似L20.0严L终浓瘦试剂ddH艺Ol0PCR缓冲液l2.5mmoI0.2mmolI04队moI0.4似moLO以molL0.04U似I2.5mgL25mmolL氯化镁溶液dNTPs混合溶液（各2.5mmolL）l0似moI.上游引物l0队molL下游引物0以molL探针7tIqINA聚合酶25mgLDNA模板总体积“”表示体积不确定如果PCR缓冲液中含有氯化镁则不加氯化镁溶液根据q酶的浓度确定其体积并相应调整ddll2O的体积,使反应体系总体积达到200似L。若采）村实时荧光PCR试剂盒则按试剂盒说明书的推荐用鼓配制反应体系仙上下游引物用毗按表执行7.52.3将PCR管放在离心机上,500g3000g离心10s然后取出PCR管放人实时荧光PCR仪中7.5.2.4进行实时荧光PCR扩增反应程序为95变性5mln;95变性15s,60退火延伸60s共进行40个循环;在第二阶段的退火延伸（60）时段收集荧光信号注:不可仪器可根据仪器耍求将反应参数作适当调憋7.5.2.2对照PcR扩增在试样PCR扩增的同时应设置PCR阳性对照、PCR阴性对照和PCR空白对照以含有对应调控元件或基因的质量分数为0.l1.0的水稻基因组I）NA（或采用对应调控元件或基因与非转基因水稻基因组相比拷贝数分数为0.11.0的DNA溶液）为阳性对照;以非转基因水稻基因组DNA作为阴性对照;以水作为空白对照除模板外对照PCR扩增与试样PCR扩增相同（见7.5.2.1）08结果分析与表述8普通PCR方法8.对照检测结果分析PCR扩增中,阳性对照内标准基因及对应调控元件和基因均得到扩增,且扩增片段大小与预期片段大小致;阴性对照仅扩增出水稻内标准基因片段;空白对照没有扩增片段表明PCR扩增体系正常工作否则重