农业农村部公告第423号-4-2021 转基因植物及其产品成分检测 抗虫棉花DAS-24236-5及其衍生品种定性 PCR方法.pdf

ICS65.020.01CCS B 04中华人民共和国国家标准农业农村部公告第423号一4一2021转基因植物及其产品成分检测抗虫棉花DAS-24236-5及其衍生品种定性PCR方法Detection of genetically modified plants and derived products-Qualitative PCR method for insect-resistant cottonDAS-24236-5 and its derivates2021-05-07发布2021-11-01实施中华人民共和国农业农村部发布农业农村部公告第423号一4一2021全酒农业食品标准公共服务平台本文件按照GB/T1.1一2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。本文件起草单位：农业农村部科技发展中心、农业农村部环境保护科研监测所、安徽省农业科学院水稻研究所、中国农业科学院棉花研究所。本文件主要起草人：修伟明、王颢潜、杨殿林、张飞燕、章秋艳、马卉、李刚、赵建宁、刘红梅、王金鑫、秦瑞英、许学、张帅。农业农村部公告第423号一4一2021二钠溶液（见5.4），加水定容至1000ml。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min。5.750TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷(Tis),先用500mL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二胺四乙酸二钠溶液（见5.4），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容至1000mL。使用时用水稀释成1XTAE。5.8加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h;称取250.0mg二甲基苯腈蓝，加10mL水溶解：称取50.0g蔗糖，加30mL.水溶解。混合以上3种溶液，加水定容至100mL,在4下保存。5.9DNA分子量标准：可以清楚地区分100bp1000bp的DNA片段。5.10 dNTPs混合溶液：将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP4种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。5.11 Taq DNA聚合酶、PCR扩增缓冲液及25mmol/L氯化镁(MgCz)溶液。5.12棉花内标准基因Sad1基因引物Sad1-F:5TGGCCTCTAATCATTGTTATGATG-3;Sadl-R:5-TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC-3注：预期扩增片段大小为282bp.来源：农业部1943号公告一1一2013，附录A中的A.1.25.13DAS24236-5转化体特异性序列引物DAS-24236-5-F:5-GCCGAAAGGTGTTAATGCTAAATTG-3;DAS-24236-5-R:5-GCTGATCCATGTAGATTTCCCGGAC-3注：预期扩增片段大小为149bp(见附录A)。5.14引物溶液：用TE缓冲液（见5.6）或水分别将上述引物稀释到10mol/L。5.15石蜡油。5.16DNA提取试剂盒。5.17定性PCR试剂盒.5.18PCR产物回收试剂盒。6主要仪器和设备6.1分析天平：感量0.1g和0.1mg。6.2PCR扩增仪：升降温速度1.5/s,孔间温度差异1.0。6.3电泳槽、电泳仪等电泳装置。6.4凝胶成像系统或照相系统。7分析步骤7.1抽样按NY/T672和农业部2031号公告一19一2013的规定执行。7.2试样制备按NY/T672和农业部2031号公告一19一2013的规定执行。7.3试样预处理按农业部1485号公告一4一2010的规定执行。7.4DNA模板制备按农业部1485号公告一4一2010的规定执行。7.5PCR扩增7.5.1试样PCR扩增2农业农村部公告第423号一4一20217.5.1.1棉花内标准基因PCR扩增按农业部1943号公告一1一2013中7.5.1的规定执行。7.5.1.2转化体特异性序列PCR扩增7.5.1.2.1每个试样PCR扩增设置3个平行。7.5.1.2.2在PCR管中按表1依次加入反应试剂，混匀，再加25L石蜡油（有热盖功能的PR仪可不加)。也可采用经验证的、效果相当的定性PCR试剂盒配制反应体系。表1定性PCR扩增体系试剂终浓度体积ddH2O10PCR扩增缓冲液12.5l25mmol/L.氯化镁溶液1.5 mmol/L.1.5ldNTPs混合溶液（各2.5mmol/L)0.2mmol/1.2.0L10 umol/I.DAS-24236-5-F0.4tmol/1.1.0l10 gmol/L DAS-24236-5-R0.4 umol/L.1.0l.Taq DNA聚合酶0.025U/l25mg/LDNA模板2.0mg/1.2.0l总体积25.04l“一”表示休积不确定，如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，根据Tag DNA聚合酶的浓度确定其体积，并相应调整ddH,O的体积，使反应体系总体积达到25.0l。若采用定性PCR试剂盒，则按试剂盒说明书的推荐用量配制反应体系，但上下游引物用量按表1执行7.5.1.2.3将PCR管放在离心机上，500g3000g离心10s,然后取出PCR管，放入PCR仪中。7.5.1.2.4进行PCR扩增。反应程序为：94变性5min:94变性30s,58退火30s,72延伸30s,共进行35次循环；72延伸5min;10保存。7.5.1.2.5反应结束后取出PCR管，对PCR扩增产物进行电泳检测。7.5.2对照PCR扩增在试样PCR扩增的同时，应设置PCR阳性对照、PCR阴性对照和PCR空白对照。以抗虫棉花DAS24236-5为阳性对照（抗虫棉花DAS24236-5的质量分数为0.1%1.0%的棉花基因组DNA,或抗虫棉花DAS242365转化体特异性序列与棉花基因组内标准基因相比的拷贝数分数为0.1%一1.0%的DNA溶液)；以非转基因棉花基因组DNA作为阴性对照；以水作为空白对照。除模板外，对照PCR扩增与试样PCR扩增相同（见7.5.1）。7.6PCR产物电泳检测按20g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100L琼脂糖溶液中加入5L,EB溶液或适量的其他核酸染料，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12LPCR产物与3L加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm5V/cm条件下电泳检测。7.7凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。如需通过序列分析确认PR扩增片段是否为日的DNA片段，按照7.8和7.9的规定执行。7.8PCR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书，回收PCR扩增的DNA片段。7.9PCR产物测序验证将回收的PCR产物测序，与抗虫棉花DAS242365转化体特异性序列（见附录A)进行比对，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。