农业农村部公告第628号-6-2022 转基因植物环境安全检测 外源杀虫蛋白对非靶标生物影响 第10部分：大型蚤.pdf

ICS65.020.0CCSB04中华人民共和国国家标准农业农村部公告第628二-62022转基因植物环境安全检测外源杀虫蛋白对非靶标生物影晌第O部分:大型蚤ThedetectiollofenvironmentasafCtyofgeneticalyInodifiedplantsEfctsofexogenousinsecticidalproteinonnon-targetorgansmsPart0:D肋2j冗Ig22023030实施202229发布蹲中华人民共禾J国农业农村部农业农村部公告第628号-6-2022一口月部分:标准化文件的结构和起草规则的规定本文件按照GBT1.12020标准化工作导则第部分:标准化文件的结构利起起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发（j机构不承担识别专利的责任本文件由中华人民共和国农业农村部提出本文件由全国农业转基冈生物安全管理标准化技术委员会归口本文件起草单位;农业农村部科技发展中心、生态环境部南京环境科学研究所本文件主耍起草人:刘标、张旭冬、张莉、梁晋刚、刘来盘、沈文静、方志翔农业农村部公告第628号6-2022转墓因植物环境安全检测外源杀虫蛋白对非靶标生物影晌第0部分:大型蚤范围本文件规定了转驰冈植物外源基因表达的杀虫蛋白对大测蚤（D帅j!g!）影问的检测方法。2引用文适用于件本白质等同333333.6半数致死浓度medianlethalconcentrationLC50暴露于受试化合物后通过统计分析获得的预期能够弓起受试生物死亡率为50的受试杀虫蛋白浓度（基于第21d大型蚤死亡率进行计算）。3.7最大耐受试验浓度maximumtoleranceconcentrationMTC与阴性对照相比受试杀虫蛋白不引起受试对象死亡率显著提高的最大浓度4原理按定剂量（浓度）把转基闪植物外源杀虫蛋白均匀混人大型蚤培养液中饲养大型蚤以混人受试蛋l农业农村部公告第628号-62022白溶剂的大型蚤培养液作为阴性对照以混人已知对大型蚤有毒的有机或无机化合物的培养液为阳性对照试验21d后观察计算大型蚤的死亡率和存活母蚤的平均新生幼蚤个数等生命参数比较分析不司处理间大型蚤生命参数的差异,明确外源杀虫蛋白对大型蚤的潜在暴露意性5试剂和材料5.溶剂用于溶解受试杀虫蛋白的蒸馏水、磷酸盐缓冲液（PBS）或其他溶剂如需要助溶剂则助溶剂在大型蚤培养液中最大浓度不超过0.5mgL且需要确保含助溶剂的溶液对大型蚤的生长和繁殖没有显著不利影响5.2受试外源杀虫蛋臼受试外源杀虫蛋白可直接从转基因植物中提取纯化获得也可经微生物表达、提取、纯化获得,但需耍确保所获得的杀虫蛋白与植物组织中表达的杀虫蛋白具有实质等同性符合农业部1485号公告172010的要求5.3阳性对照化合物采用重铬酸钾（potassiumdichromate,K2Cr2O7）（分析纯）作为阳性对照化合物为验证试验蚤的敏感性和检查试验步骤的统性每次进行评价试验时应先测定试验蚤敏感性,测试方法可按照GBT132661991中8.4的规定执行重铬酸钾的24hEC50（半数抑制浓度）在20时应在0.5mgL1.2mgL范围内54大型蚤的选择保持良好的培养条件,使大型蚤的繁殖处于孤雌生殖的状态（GBT132661991中的附录A）随机选择实验室条件下培养3代以上、遗传背景相同的6h24h幼蚤为试验蚤5.5大型蚤人工饵料推荐使用实验室培养的斜生栅藻（Sce?“e!wl!oMg“J）为大型蚤饵料制备方法可按照GBT13266l991中的附录B的规定执行56大型蚤培养液大型蚤培养液见附录A。6试验仪器66.2636电子天平:感量为0.01mg离心机酶标仪烧杯或结晶l:50mL100mL骤止少验试了7.试验处理7.阴性对照组:在大型蚤培养液中混人等质量受试杀虫蛋白的溶剂7.2阳性对照组:将重铬酸钾均匀混人大型蚤培养液中浓度为500队gL7.3受试杀虫蛋白处理组:在大型蚤培养液中均匀混人受试外源杀虫蛋白,浓度要求为大型蚤在自然条件下可能暴露的受试杀虫蛋白最高浓度的10倍以上（可将大型蚤在自然生活的水体中所能测定到的受试杀虫蛋白的最高浓度作为受试大型蚤可能暴露的受试杀虫蛋白最高浓度）如果发现受试外源杀虫蛋臼对大型蚤有显著不利影问,则需要进步试验和计算出LC50试验浓度的设置可按照GBT13266l99l中的附录C的规定执行;如果无法或不需要计算LC50,则只需设1个符合要求的浓度72各试验组材料准备2农业农村部公告第628号-6一202272受试杀虫蛋白应先溶解或均匀悬浮于灭菌蒸馏水、PBS或其他溶剂中7.22如果需要助溶剂,应保证该含助溶剂的溶液对大型蚤没有不利影响且要在对照培养液中川人等量该溶液。7.23先将制备好0受试杀虫蛋白或对照化合物）人蛋白溶剂或助溶剂中,再与大型蚤培养液充分混匀7.3试验操作与记录7.3试验在光照培养箱或者人工气候室内进行,培养温度为（201）,光周期16h:8h（L:D）培养液的适宜pH为（7.80,2）溶解氧保持在2mgL以上试验操作及试验过程中试验蚤不能离开培养液转移操作过程不得对试验蚤造成损伤7.3.2随机选择的受试大型蚤单只置于50mL100mL小烧杯或者结晶等适宜器中每器添50mL培养液每个处!不少于4个重复每个重复10只大型蚤测试过程中,每日添加斜生栅藻饵料至培养器中,使其在培养液中的浓度约为105个L每2d3d更换培养液。73.3每天观察、记录试验蚤生长发育情况如死亡头数、新生幼蚤数;新生幼蚤产出后每天从试验器l中移出。试验持续时间为2d8质量保证与控制8.受试杀虫蛋白在大型蚤培养液中的稳定性检测在含受试杀虫蛋白的培养液提供给大型蚤前和24h后,分别取3个5个样品（每样品2mL）,于20冰箱中保存可采用酶联免疫法（ELISA）或其他蛋白测定方法检测样品中受试杀虫蛋白的含量暴露于大型蚤饲养环境条件24h后的培养液中受试杀虫蛋白浓度应不低于新鲜培养液中受试杀虫蛋白浓度的50;如果受试杀虫蛋白降解率超过50需要补加受试蛋白至初始浓度82试验体系台格性检测阴性对照组大型蚤的死亡率低于20存活母蚤的平均产新生幼蚤数大于60头阳性对照组大型蚤死亡率显著高于阴性对照组表明试验体系工作正常可用于检测外源杀虫蛋白对大型蚤的潜在毒性;否则,需要查找原因,重新进行试验9结果分析与表述9数据处理根据试验记录计算大型蚤死亡率和存活母蚤的平均产新生幼蚤数数据以表格的形式描述死亡率用百分数描述,新生幼蚤数用平均值标准差（样本数1）描述可用成对比较（pairwlse）统计分析受试杀虫蛋白处理组与阳性对照组、阴性对照组的差异如果受试杀虫蛋白处理组与阴性对照组具有显著性差异并可求得受试杀虫蛋白的LC50,则通过概率单位法（Probltanaysls）、寇氏法（Korbor）或其他计算方法求得LC50;如果无法求得LC50,仅给出实际的统计分析数据即可。92结果表述根据统计分析结果,评估转基因植物外源杀虫蛋白对大型蚤的潜在暴露意性结果表述为“与阴性对照组相比,受试杀虫蛋白处理组的试验蚤（死亡率、存活母蚤的平均产新生幼蚤数）增加（或减少）,差异达（未达）显著（极显著）水平”如果受试杀虫蛋白处理组与阴性对照组大型蚤死亡率有显著性差异,并可求得LC5o,结果表述为“受试杀虫蛋白对大型蚤的半数致死浓度为”;如果受试杀虫蛋白处理组与阴性对照组大型蚤死亡率没有显著性差异结果表述为“大型蚤对该杀虫蛋白的暴露寿性最大耐受浓度（MTC）（最大试验浓度）”3农业农村部公告第628号-62022附录A（规范性）大型蚤培养液A配方见表A.。!蚤培养掖筛翻覆配方4心馏水帅人的峨.兰兰苫序号川小四缅固朋庐汕一司】司卢黔副毯。喘喇刚避小巴川川叫卯卵沥A.2配置刀法A2.液新解氧浓如:氯、A2,2L卿为大型蚤培养!）R嚣溺忘!,富U4曰臼田栅舶吊蒋悍弓悍中华人民共利国到家标准转基因植物环境安全检测外源杀虫蛋臼对非靶标生物影晌第0部分:大型蚤农业农村部公告第628号-62022兴瓣兴中国农业出版社出版（北京巾朝（日仪发子店街18号楼）（!政编码:100125网址:）北京刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销兴并瓣开本880mm1230mm116印张0.75字数15千宁2023年2月第1版2023年2月北京第1次印刷书号:16109。9329定价:24.00元版权专有侵权必究举报电话:（00）599426农业农村部公告第628号-6-2022