农业农村部公告第628号-9-2022 转基因植物及其产品成分检测 大豆常见转基因成分筛查.pdf

ICS65.020.0CCSB04中华人民共禾口国国家肃示准农业农村部公告第628号9-2022转基因植物及其产品成分检测大豆常见转基因成分筛查DetectionofgeneticallyInodifiedplanltsandderivedproducts-Screeningofcommongeneticallymodifiedcomponentsinsoybean2023030实施202229发布淳中华人民共和国农业农村部农业农村部公告第628号-9-2022目-一口本文件按照GBTl.l2020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起革。请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由中华人民共利国农业农村部提l。本文件由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口本文件起草单位:农业农村部科技发展中心、山西农业大学本文件主要起草人:高建华、张秀杰、史宗勇、陈子言、刘珊、许冬梅、张雨碘、李夏莹、梁晋刚、王颖潜、郭俊（、赵娟丽农业农村部公告第628号9一2022转基因植物及其产品成分检测大豆常见转基因成分筛查范围本文件规定了大豆中常见转基因成分的定性筛查方法3.5c.yJAc基因c.yIACgene编码苏云金芽抱杆菌（BcM!tij!gje厕N）cry1Ac杀虫晶体蛋白的基因3.6E9终止子terminatorofrib11los佳5biphosphatecarboxylasesmallsubunit来自豌豆核酮糖,5二磷酸竣化酶小亚基（rlbulose,5bjphosphatecarboxyasesmasubunlt）基因的3端终止序列4原理依据l6币转基因大豆转化体中常见05嗣调控元件利基因序列,选择特异性引物及探针对试样进拘农业农村部公告第628号-9-2022ICR扩增依据是否扩增获得预期的INA片段或典型扩增线,判断样品中是否含有相应的转基因成分5试剂和材料除非另有说明,仅使用分析纯试剂和重蒸馏水5琼脂糖5210gL澳化乙锭（EB）溶液:称取L0g漠化乙锭溶解于00mL水中,避光保存警告澳化乙锭有致癌作用配制和使用时应戴-次性手套操作并妥善处理废弃物。注:根据需耍可选择共他效果相当的核酸染料代替澳化乙锭作为核酸电泳的染色剂53l0molL氢氧化钠（Na（）H）溶液:在160mL水中加人80.0g氢氧化钠溶解后,冷却至室温,再川水定容至200mL54500mmolL乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）溶液（pH8.0）:称取18.6g乙二胺四乙酸二钠加入70mL水中缓慢滴加氢氧化钠溶液（见5.3）直至EDTANa2完全溶解用氢氧化钠溶液（见5.3）调pH至80加水定容至100mL在103.4kPa（121）条件下灭菌20mjn5.51moL三轻甲基氨基甲烷-盐酸（TrisHC）溶液（pH8.0）:称取121.1g三轻甲基氨基甲烷溶解于8（）0mL水中用盐酸调pH至8.0加水定容至000mL在103.4kPa（121）条件下灭菌20mln5.6TE缓冲液（pH8.0）鼠分别量取10mL三轻甲基氨基甲烷盐酸溶液（见5.5）利2mL乙二胺四乙酸二钠溶液（见5.4）,加水定容至1000mL在103.4kPa（121）条件下灭菌20mm5.750TAE缓冲液:称取242.2g三轻甲基氨基甲烷（Tris）先用500mL水加热搅拌溶解后,川人（）0mL乙二胺四乙酸二钠溶液（见5.4）,用冰乙酸调pH至8.0然后加水定容至1000mL使用时用水稀释成1TAE。5.8样缓冲液:称取250.0mg漠酚蓝,川人10mL水,在室温下溶解12h;称取250.0mg二甲基苯腊滥,10mL水溶解;称取50.0g蔗糖加30mL水溶解混合以上3种溶液,加水定容至100mL,在4下保存59INA分子量标准:可以清楚区分100bp1000bp的DNA片段5.0dNTPs混合溶液:将浓度为10mmolL的dATP、dTTP、dGTP、dCTP4种脱氧核糖核昔酸溶液等体积混合5IhqDNA聚合酶PCR扩增缓!液及25mmolL氯化镁（MgCl2）溶液52普通PCR方法引物检测参数的普通PCR方法引物序列及目的片段大小见表1。表普通PCR方法引物组合信息表检测参数引物Lcc1ln-FLcclnRPCaMV35SFPCaMV35SRTNOSFTN（）SRpa1FpalRcrylAGFcry1AoRTe9FO9R序列（53）GGGIAGGATAGGGTTCTCTGGCGATCGAGTAGTGAGAGTCGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAGTGGATTGTGCGTCATCCCGAATCCTGTTGCCGGTCTTGlTTCCTAGTTTGCGCGCTACCGGAGAGGAGACCAGTTGAGATTICAGGGCCCAGCGTAAGGAAGGTTTGAGCAATCTCTACCGATCAGCCTAGTAAGGTCGTCGCACACACCAGAATCCTACTGAAGGCCACGATTTGCC目的片段大小,bpL“基闲2I0（hMV35S启动子l95M乃终止子80基天227.门Ac睡因30卿终止子28553实时荧光PCR方法引物和探针检测参数的实时荧光PCR方法引物探针序列及目的片段大小见表2探针5端标记荧光报告基团2农业农村部公告第628号-9-2022（如FM、HEX等）,3端标记对应的淬灭基团（TAMRA、BHQ1等）表2实时荧光PCR方法引物探针信息表序列（53）目的片段大小,bp检测参数引物探针（CCCTCTACTCCACCCCCA（CcCATcTGcGCcrTTTrAGClvlCGCCGCTTCCI苹lAACTTCACC（jCAGTGGTCCCAAAGAGCGTGGTTGGACGTCTTCLcclnqFl8Lcc1lnqRL“jl苯月Lcc1mqPPCaMV35SqF7子动幻口）日日帅PCaMV35SqRGGGAGCA尸T（PCaMV35SqP厂ATCGTTCAATCGTTCAN（）SqF巴厂l65AITGCGG（i（lN（）SqRNOS终止子刁CAG（NOSqPMjM匝血I沪（眶傅叼i厂厂GalqFM四9苯月pa1腿Vpd闯瞬J沏阿什g睡g霹霄撼疆透疆瞬颐蹿露蜒h凹旦凶盯,翅C厂A（蛀月睡翱瓣Fcryl压q阿.cry硼鹰洲螺削呼肌醒bq八V戮霞蘸露翻露墅藤腾肌9o）l（）8E9终k子霹瓣旷冲旧臼江蛇巴5555554567896主6.6.26.366.57操7抽样按NYT672利农业部2031号公告192013的规定执行72试样制备按NYT672利农业部203.号公告19-2013的规定执行73试样预处理按农业部M85号公告420l0的规定执行7.4DNA模板制备按农业部1485号公告42010的规定执行75PCR扩增农业农村部公告第628号9-20227.5普通PCR方法7.5.试样PCR扩增75.每个试样PCR扩增设置3个平行7.5.2按表3依次加人反应试剂混匀,分装到PCR管中,再加25似L石蜡油（有热盖功能的PCR仪可不加）也可采用经验证的、效果相当的定性PCR试剂盒配制反应体系表3普通PCR扩增体系试剂ddH2O0PCR缓冲液25mmolL氯化镁溶液dNTPs混合溶液（各2.5mmolL）l0molI.上游引物终浓度体积25尸L5严L20似Ll.0似Ll0队I.2.0似L25.0似Ll.5mmoI0.2mmolL0.4队molI.0.4队moI0.05U似L20mgL0么moL下游引物7hqDNA聚合酶25mgLDNA模板总体积“,表示体积不确定,果PCR缓液中含有熟化镁则不加氯化镁溶液,根掘Thq酶的浓度定其体积,并相应调整dH2（）的体积使反应体系总体积达到25.0LL若采用定性PCR试剂盒则按试剂盒说明书的推荐用量配制反应体系但上下游引物用量按表3执行75.3将PCR管放在离心机上,500g3000g离心10s,然后取出PCR管,放人PCR仪中75川进行PCR扩增.反应程序为:94变性5min;94变性30s,58退火30s72延伸30s,共进行35次循环;72延伸7mm;10保存75川5反应结束后取出PCR管对PCR扩增产物进行电泳检测。752对照PcR扩增在试样PCR扩增的同时,应设置PCR阳性对照、PCR阴性对照和PCR空白对照以含有对应调控元件或基因的质量分数为0.11.0的大豆基因组DNA（或采用对应调控元件或基因与非转基因大豆基因组相比拷贝数分数为0.11.0的DNA溶液）为阳性对照;以非转基因大豆基因组DNA作为阴性对照;以水作为空白对照。除模板外,对照PCR扩增与试样PCR扩增相同（见7.5,1.1）7.5.3PCR产物电泳检测按20gL的质量浓度称量琼脂糖加人TAE缓液中,加热溶解,配制成琼脂糖溶液每100mL琼脂糖溶液中加人5似LEB溶液或适量的其他核酸染料混匀稍适冷却后将其倒人电泳板上插上梳板室温下凝固成凝胶后放人1TAE缓冲液中垂直向上轻轻拔去梳板取12似LPCR产物与3似L加样缓冲液混合后加人凝胶点样孔同时在其中个点样孔中加人DNA分子量标准接通电源在2Vcm5Vcm条件下电泳检测7.5.4凝胶成像分析电泳结束后,取出琼脂糖凝胶,置于凝胶成像仪上成像根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照如需通过序列分析确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段按照7.5.1.5和7.51.6的规定执行75l5PcR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书,回收PCR扩增的DNA片段75.6PcR产物测序验证将回收的PCR产物测序,与对应调控元件或基因的序列（参见附录B）进行比对,确定PCR扩增的DNA片段是否为目的I）NA片段Zl农业农村部公告第628号920227.5.2实时荧光PCR方法75.2试样PCR扩增7.52每个试样PCR扩增设臂3个平行75.22按表4依次加人反应试剂,混匀,分装的PCR管也可采用经验证的、效果相当的实时荧光PCR试剂盒配制反应体系表4实时荧光PCR扩增体系试剂ddH,O体积2.0I2.0供L1.6似L08L08供L0.4队L20队L200以L终浓瘦0PCR缓冲液25mmolI.氯化镁溶液12.5mmolL0.2mmolI0.4似molI0.4尸molL0.2严molL0.0U似L2。5mgIdNTPs混合溶液（各2.5mmolL）0仪molL上游引物0似molI下游引物l0么molI.探针7tqDNA聚合酶25mgLDNA模板总体积“”表示体积不确定如果PCR缓冲液中含有氯化镁,则不氯化镁溶液,根据hq酶的浓度确定其体积,并相应调整ddll盟O的体积,使反应体系总体积达到20.0队L若采州实时荧光PCR试剂盒,则按试剂盒说明书的推荐用量配制反应体系但上下游引物用量按表4执行75.2.3将PCR管放在离心机上,500g3000g离心10s然后取出PCR管放人实时荧光PCR仪中7.5.2.q进行实时荧光PCR扩增反应程序为95变性5mln;95变性15s60退火延仰606共进行40个循环;在第二阶段的退火延（60）时段收集荧光信号注:可根掘仪器和试剂耍求将反应参数作适当调憋7.5.22对照PCR扩增在试样PCR扩增的同时,应设置PCR阳性对照、PCR阴性对照利PCR空白对照以含有对应调控元件或基因的质量分数为0.11.0的大豆基因组DNA（或采用对应调控元件或基囚与非转基因大豆基因组相比拷贝数分数为0.1L0的DNA溶液）为阳性对照;以非转基因大豆基囚组INA作为阴性对照i以水作为空白对照除模板外,对照PCR扩增与试样PCR扩增相同（见7.5.2.1）8结果分析与表述8.普通PCR方法8对照检测结果分析PCR扩增中,阳性对照内标准基因及对应调控元件和基因均得到扩增且扩增片段大小与预期片段大小一致;阴性对照仅扩增出大豆内标准基因片段;空白对照没有扩增片段,表明PCR扩增体系正常工作否则,重新检测8.2样品检测结果分析和表述8.2.试样大豆内标准基因扩增出预期大小的片段对应调控元件或基因C