GBT 40457-2021 咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法.pdf

书 书 书犐 犆犛 犆犆犛犅 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准犌犅犜 咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法犇犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犻 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犆狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿犽 犪 犺 犪狑犪 犲犑 犕犠犪 犾 犾 犲 狉牔犅 狉 犻 犱 犵 犲 发布 实施国 家 市 场 监 督 管 理 总 局国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布书 书 书前言本文件按照 标准化工作导则第部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（）提出并归口。本文件起草单位：宁波检验检疫科学技术研究院、中国科学院微生物研究所、中华人民共和国天津海关。本文件主要起草人：段维军、蔡磊、刘芳、李雪莲、张慧丽、赵鹏、廖芳、陈先锋。犌犅犜 咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法范围本文件描述了咖啡浆果炭疽病菌形态学和分子生物学特征的鉴定检测方法。本文件适用于携带咖啡浆果炭疽病菌的植物及其产品中咖啡浆果炭疽病菌的检测。规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。分类信息中文名：咖啡浆果炭疽病菌学名：犆狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿犽 犪 犺 犪狑犪 犲 分类地位：真菌界（），子囊菌门（），盘菌亚门（），粪壳菌纲（），肉座菌亚纲（），小丛壳目（），小丛壳科（），刺盘孢属（犆狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿）。分布、寄主、传播途径等信息见附录。鉴定原理根据咖啡浆果炭疽病菌在寄主植物上的症状，抽取可疑样品进行病原菌分离培养，按照病原菌的形态特征和实时荧光特异性反应进行鉴定。仪器设备、器具、试剂和培养基 仪器设备和器具高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、天平、水浴锅、纯水仪、涡旋振荡器、高速冷冻离心机、冰箱、生化培养箱、实时荧光仪、紫外分光光度计、微量移液器（、）、研钵、锥形瓶、培养皿、载玻片、盖玻片、灭菌滤纸。试剂十六烷基三甲基溴化铵（）提取液（，）、三羟甲基氨基甲烷（）饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、酶、超纯水、实时荧光聚合酶链式反应（）反应预混液：犜犪 狇 犌犅犜 （宜使用，亦可自行配制）。除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。培养基麦芽汁培养基（）：麦芽汁，蛋白胨，琼脂，加蒸馏水配制。配成溶液后 下灭菌 。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（）：马铃薯 ，葡萄糖，琼脂粉，加蒸馏水配制。配成溶液后 下灭菌 。检疫鉴定 分离培养切取发病材料病健交界处的植物组织（约 ），用 乙醇浸泡 进行表面消毒，无菌水冲洗次后置于灭菌滤纸上，吸干水分后放置于倒有麦芽汁培养基（）的培养皿中。培养皿放置在温度为 条件下光照培养箱中培养（光照和黑暗各 交替）。培养后，挑取可疑菌落边缘的菌丝进行纯化培养。形态学观察显微镜观察孢子的形态特征、产孢方式。观察记录菌落的直径、颜色、分生孢子和附着胞的形成情况等（见图）。犇犖犃制备制备按照附录的方法提取。犇犖犃纯度与浓度的测定用紫外分光光度计测定的纯度与浓度，分别读取 和 处的吸收值，计为 、。的纯度 比值应为 ，的浓度为 倍的 （）。的浓度与纯度应符合实时荧光聚合酶链式反应（）检测的要求。实时荧光犘犆犚检测实时荧光聚合酶链式反应（）方法按照附录的方法检测。鉴定特征 症状该病害可以发生在咖啡树生长的所有阶段，主要危害咖啡浆果，造成果实脱落，偶尔侵染叶片。浆果表面初时呈现近圆形水渍状小斑点，后病斑变成凹陷，暗褐色至灰黑色大病斑，其上长出粉红色黏液状物。病叶上可见褐色炭疽状病斑，其上有许多黑色小点（病原菌的分生孢子）排列成同心轮纹（见图）。鉴定特征在温度为 下，咖啡浆果炭疽菌培养物在麦芽汁培养基（）平板上生长后，菌落直犌犅犜 径可达 ，正面灰色至深橄榄灰色，背面深绿色。继代培养的菌落的颜色发生变化，多为灰白色或棕色。分生孢子着生于菌丝上，直立，圆柱形，无分隔，两端钝圆，（）（）。附着胞浅褐色至褐色，圆形或不规则，（）（）（见图）。实时荧光犘犆犚鉴定在阴性对照、空白对照正常的情况，则有如下判定：样品无 值并且无扩增曲线，判定为阴性；样品 值 ，且出现典型的扩增曲线，判定为阳性；样品 值在 之间时，应重新提取样品进行扩增检测。重做 值大于，判为阴性；否则判为阳性；样品 值大于 时，判定为阴性。结果判定若症状明显符合 鉴定特征，且培养物培养特征符合 鉴定特征，判定为检出咖啡浆果炭疽病菌。若症状不明显，但培养物培养特征符合 鉴定特征，且实时荧光检测结果为阳性，判定为检出咖啡浆果炭疽病菌。样品保存、记录与复核 样品保存、记录保存样品应置于冰箱妥善保存，对检出咖啡浆果炭疽病菌的样品应至少保存个月。菌株保存于冷藏箱，核酸样品保存于 或 冰箱。以备复检、谈判和仲裁。分离到的咖啡浆果炭疽病菌应接种于马铃薯葡萄糖琼脂（）培养基中妥善保存。记录包括：样品的来源、种类、采样时间、检测时间、地点、方法、结果等，并有试验人员的签字。实时荧光要有检测阳性结果照片。复核由指定的单位或人员负责，主要考察试验原始数据记录及实时荧光结果等资料的完整性和真实性，必要时进行复核试验。犌犅犜 附录犃（资料性）咖啡浆果炭疽病菌基本信息犃 地理分布非洲：安哥拉、布隆迪、喀麦隆、中非共和国、刚果（金）、埃塞俄比亚、肯尼亚、马拉维、莫桑比克、卢旺达、南非、坦桑尼亚、乌干达、赞比亚、津巴布韦。中美洲：古巴。欧洲：意大利。犃 寄主咖啡，包括小粒种犆狅 犳犳 犲 犪犪 狉 犪 犫 犻 犮 犪、中粒种犆狅 犳犳 犲 犪犮 犪 狀 犲 狆犺 狅 狉 犪和大粒种犆狅 犳 犳 犲 犪犾 犻 犫 犲 狉 犻 犮 犪。犃 传播途径染病浆果为初侵染源，也可借助人类耕作活动、鸟类、昆虫、雨水等进行传播，远距离传播通过带病植株相关贸易进行传播。犃 危害情况咖啡浆果炭疽病是一种毁灭性的病害，主要危害小粒种咖啡的绿色浆果和叶片，极易造成果实脱落，并可使咖啡果实产量损失 。浆果表面初时呈现近圆形水渍状小斑点，后病斑变成凹陷，暗褐色至灰黑色大病斑，其上长出粉红色黏液状物（见图）。图犃 咖啡浆果炭疽病菌危害咖啡叶片和浆果的病害症状（引自犠犪 犾 犾 犲 狉犲 狋犪 犾 ）犃 形态特征咖啡浆果炭疽病菌培养物形态特征图见图。犌犅犜 说明：附着胞；分生孢子；不同菌株在马铃薯葡萄糖琼脂（）上培养 的菌落形态，上为正面、下为反面。注：上标尺为，适用于。图犃 咖啡浆果炭疽病菌的形态特征（引自犠犲 犻 狉犲 狋犪 犾 ）犌犅犜 附录犅（规范性）十六烷基三甲基溴化铵（犆犜犃犅）提取犇犖犃方法犅 收集培养分离得到的菌丝或植物材料放入 离心管中，加入 石英砂或粒粒玻璃珠和 十六烷基三甲基溴化铵（）抽提液，用破碎仪或无菌玻璃杵碾碎菌丝体或植物材料。犅 加入 预热的抽提液，颠倒混匀后于 水浴。犅 冷却至室温后，离心 ，取上清液至另一离心管中。犅 加入体积（）的三羟甲基氨基甲烷（）饱和酚及体积（）的氯仿异戊醇（），颠倒混匀后静置至其开始分层。犅 离心 ，取上清液至另一离心管中。犅 可重复 至 步次次，视两相界面处杂质的多少而定。犅 加入等体积氯仿异戊醇（），轻轻颠倒混匀。犅 离心 ，取上清液至另一离心管中。犅 向上清液中加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混合均匀后于或 沉淀。犅 离心 ，弃去上清液，加 乙醇悬浮沉淀。犅 离心，弃上清，室温干燥。犅 加 无菌水或三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸（，）缓冲液配方：（），（），加超纯水定容至 溶解沉淀，贮存备用。犌犅犜 附录犆（规范性）实时荧光犘犆犚方法犆 引物及探针序列正向引物：。反向引物：。探针：。犜犪 狇 探针（）采用 末端（）标记作为荧光报告染料，末端（）标记作为荧光淬灭染料。犆 反应体系扩增反应体系（总体积为）：犜犪 狇 、引物 各 、探针 ，模板，加入去离子水补齐。将反应体系混合均匀后置于荧光仪中进行反应。以咖啡浆果炭疽病菌作阳性对照、不含咖啡浆果炭疽病菌的作阴性对照、以无菌蒸馏水作空白对照，每个样品设置个重复。犆 扩增条件反应条件为：；然后 ，共 个循环。犌犅犜 书 书 书犌犅犜 参考文献，（）犆狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿 ：，（）犆狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿 ：，（）犆狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿 犆犪犿犲 犾 犾 犻 犪：犆犵 犾 狅 犲 狅 狊 狆 狅 狉 犻 狅 犻 犱 犲 狊 ：，（）犆狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿 ，：，（）（犆狅 犳犳 犲 犪犪 狉 犪 犫 犻 犮 犪）：，（）犆狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿犵 犾 狅 犲 狅 狊 狆 狅 狉 犻 狅 犻 犱 犲 狊 ：（犆狅 犳犳 犲 犪 ）：，（）：犆狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿犵 犾 狅 犲 狅 狊 狆 狅 狉 犻 狅 犻 犱 犲 狊 ：，（）犆狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿犽 犪 犺 犪狑犪 犲 （）：，（），犆狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿犽 犪 犺 犪狑犪 犲 ：，（）犆狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿犵 犾 狅 犲 狅 狊 狆 狅 狉 犻 狅 犻 犱 犲 狊 ：陶刚，蔡磊一种咖啡浆果炭疽病菌快速分子检测试剂盒及其应用国家发明专利，专利号：犜犅犌版权专有侵权必究书号：定价：元