GB 4789.4-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验.pdf

书 书 书?犌犅?书 书 书犌犅 前言本标准代替 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验、出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）检验方法、乳及乳制品卫生微生物学检验方法第部分：沙门氏菌检验。整合后的标准与 相比，主要变化如下：修改了检测流程和血清学检测操作程序；修改了附录和附录。犌犅 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验范围本标准规定了食品中沙门氏菌（犛犪 犾犿狅 狀 犲 犾 犾 犪）的检验方法。本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：冰箱：。恒温培养箱：，。均质器。振荡器。电子天平：感量。无菌锥形瓶：容量 ，。无菌吸管：（具 刻度）、（具 刻度）或微量移液器及吸头。无菌培养皿：直径，。无菌试管：、。计或比色管或精密试纸。全自动微生物生化鉴定系统。无菌毛细管。培养基和试剂 缓冲蛋白胨水（）：见。四硫磺酸钠煌绿（）增菌液：见。亚硒酸盐胱氨酸（）增菌液：见。亚硫酸铋（）琼脂：见。琼脂：见。木糖赖氨酸脱氧胆盐（）琼脂：见。沙门氏菌属显色培养基。三糖铁（）琼脂：见。蛋白胨水、靛基质试剂：见。尿素琼脂（）：见。氰化钾（）培养基：见 。赖氨酸脱羧酶试验培养基：见 。糖发酵管：见 。邻硝基酚 半乳糖苷（）培养基：见 。半固体琼脂：见 。犌犅 丙二酸钠培养基：见 。沙门氏菌、和 诊断血清。生化鉴定试剂盒。检验程序沙门氏菌检验程序见图。图沙门氏菌检验程序犌犅 操作步骤 预增菌无菌操作称取（）样品，置于盛有 的无菌均质杯或合适容器内，以 均质 ，或置于盛有 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需调整，用 无菌或 调至 。无菌操作将样品转至 锥形瓶或其他合适容器内（如均质杯本身具有无孔盖，可不转移样品），如使用均质袋，可直接进行培养，于 培养。如为冷冻产品，应在 以下不超过 ，或不超过 解冻。增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取，转种于 内，于 培养 。同时，另取，转种于 内，于 培养 。分离分别用直径的接种环取增菌液环，划线接种于一个 琼脂平板和一个琼脂平板（或琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板），于 分别培养 （琼脂平板）或 （琼脂平板、琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表。表沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色琼脂菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定 生化试验 自选择性琼脂平板上分别挑取个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 培养 ，必要时可延长至。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表。犌犅 表沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂斜面底层产气硫化氢赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断（）（）可疑沙门氏菌属（）（）可疑沙门氏菌属（）（）可疑沙门氏菌属非沙门氏菌非沙门氏菌注：产碱，：产酸；：阳性，：阴性；（）：多数阳性，少数阴性；：阳性或阴性。接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（）、氰化钾（）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于 培养 ，必要时可延长至，按表判定结果。将已挑菌落的平板储存于或室温至少保留，以备必要时复查。表沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（）靛基质 尿素氰化钾（）赖氨酸脱羧酶注：阳性；阴性；阳性或阴性。反应序号：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、和赖氨酸脱羧酶项中有项异常，按表可判定为沙门氏菌。如有项异常为非沙门氏菌。表沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 尿素氰化钾（）赖氨酸脱羧酶判定结果甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）沙门氏菌或（要求符合本群生化特性）沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）注：表示阳性；表示阴性。反应序号：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。反应序号：补做。阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。必要时按表进行沙门氏菌生化群的鉴别。犌犅 表沙门氏菌属各生化群的鉴别项目卫矛醇山梨醇水杨苷丙二酸盐注：表示阳性；表示阴性。如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据 的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。血清学鉴定 检查培养物有无自凝性一般采用 琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。首先排除自凝集反应，在洁净的玻片上滴加一滴生理盐水，将待试培养物混合于生理盐水滴内，使成为均一性的混浊悬液，将玻片轻轻摇动 ，在黑色背景下观察反应（必要时用放大镜观察），若出现可见的菌体凝集，即认为有自凝性，反之无自凝性。对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定。多价菌体抗原（犗）鉴定在玻片上划出个约的区域，挑取环待测菌，各放环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加滴多价菌体（）抗血清，在另一区域下部加入滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌苔研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如）培养基上再检查；如果是由于 抗原的存在而阻止了凝集反应时，可挑取菌苔于生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。多价鞭毛抗原（犎）鉴定操作同 。抗原发育不良时，将菌株接种在 半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过接种装有 半固体琼脂的小玻管次次，自远端取菌培养后再检查。血清学分型（选做项目）犗抗原的鉴定用多价血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株，不能分型。被多价血清凝集者，依次用；、；和 因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定群。被、血清凝集的菌株，再用、单因子血清做凝集犌犅 试验，判定、各亚群，每一个抗原成分的最后确定均应根据单因子血清的检查结果，没有单因子血清的要用两个复合因子血清进行核对。不被多价血清凝集者，先用种多价血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的群血清逐一检查，以确定群。每种多价血清所包括的因子如下：多价，群（并包括，群）多价，群多价，群多价，群多价，群多价，群多价，群多价，群多价，群 犎抗原的鉴定属于各群的常见菌型，依次用表所述因子血清检查第相和第相的抗原。表犃犉群常见菌型犎抗原表群第相第相（不产气的）（产气的），无无，无无，无不常见的菌型，先用种多价血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种因子血清逐一检查，以第相和第项的抗原。种多价血清所包括的因子如下：多价，多价，多价，多价，；，；，；，；多价，多价，多价，多价，每一个抗原成分的最后确定均应根据单因子血清的检查结果，没有单因子血清的要用两个复合因子血清进行核对。检出第相抗原而未检出第相抗原的或检出第相抗原而未检出第相抗原的，可犌犅 在琼脂斜面上移种代代后再检查。如仍只检出一个相的抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。位相变异试验方法如下：简易平板法：将 半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。小玻管法：将半固体管（每管约）在酒精灯上溶化并冷至，取已知相的因子血清 ，加入于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，待凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清 的量加入。小倒管法：将两端开口的小玻管（下端开口要留一个缺口，不要平齐）放在半固体管内，小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化，冷至，挑取因子血清环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，待凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种软琼脂斜面，于 培养后再做凝集试验。犞 犻抗原的鉴定用 因子血清检查。已知具有 抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柏林沙门氏菌。菌型的判定根据血清学分型鉴定的结果，按照附录或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告（）样品中检出或未检出沙门氏菌。犌犅 附录犃培养基和试剂犃 缓冲蛋白胨水（犅犘犠）犃 成分蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钠（含 个结晶水）磷酸二氢钾 蒸馏水 犃 制法将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约 ，煮沸溶解，调节至 ，高压灭菌 ，。犃 四硫磺酸钠煌绿（犜犜犅）增菌液犃 基础液蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 碳酸钙 蒸馏水 除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节至 ，高压灭菌 ，。犃 硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠（含个结晶水）蒸馏水加至 高压灭菌 ，。犃 碘溶液碘片 碘化钾 蒸馏水加至 将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。犃 煌绿水溶液煌绿 犌犅 蒸馏水 溶解后，存放暗处，不少于，使其自然灭菌。犃 牛胆盐溶液牛胆盐 蒸馏水 加热煮沸至完全溶解，高压灭菌 ，。犃 制法基础液 硫代硫酸钠溶液 碘溶液 煌绿水溶液 牛胆盐溶液 临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。犃 亚硒酸盐胱氨酸（犛犆）增菌液犃 成分蛋白胨 乳糖 磷酸氢二钠 亚硒酸氢钠 胱氨酸 蒸馏水 犃 制法除亚硒酸氢钠和 胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至 以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和 胱氨酸溶液（称取 胱氨酸，加 氢氧化钠溶液，使溶解，再加无菌蒸馏水至 即成，如为 胱氨酸，用量应加倍）。摇匀，调节至 。犃 亚硫酸铋（犅犛）琼脂犃 成分蛋白胨 牛肉膏 葡萄糖 硫酸亚铁 磷酸氢二钠 煌绿 或 水溶液 柠檬酸铋铵 犌犅 亚硫酸钠 琼脂 蒸馏水 犃 制法将前三种成分加入 蒸馏水（制作基础液），硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入 和 蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一 和 蒸馏水中，琼脂加入 蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至 左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节至 ，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至 。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过 会降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。犃 犎犈琼脂（犎犲 犽 狋 狅 犲 狀犈狀 狋 犲 狉 犻 犮犃犵 犪 狉）犃 成分蛋白胨 牛肉膏 乳糖 蔗糖 水杨素 胆盐 氯化钠 琼脂 蒸馏水 溴麝香草酚蓝溶液 指示剂 甲液 乙液 犃 制法将前面七种成分溶解于 蒸馏水内作为基础液；将琼脂加入于 蒸馏水内。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内，调节至 。再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷至 倾注平皿。注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其