GBT 16175-2008 医用有机硅材料生物学评价实验方法.pdf

书书书犐 犆 犛 犆 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准犌 犅犜 代替 医用有机硅材料生物学评价试验方法犅 犻 狅 犾 狅 犵 犻 犮 犪 犾 犲 狏 犪 犾 狌 犪 狋 犻 狅 狀狋 犲 狊 狋犿 犲 狋 犺 狅 犱 狊 犳 狅 狉犿 犲 犱 犻 犮 犪 犾 狅 狉 犵 犪 狀 犻 犮 狊 犻 犾 犻 犮 狅 狀犿 犪 狋 犲 狉 犻 犪 犾 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布书书书目次前言?引言?范围?规范性引用文件?评价与试验选择?样品制备?细胞毒性试验?迟发型超敏反应试验?刺激试验?急性全身毒性试验?亚急性（亚慢性）和慢性全身毒性试验?热原试验?遗传毒性试验?植入试验?溶血试验?附录（资料性附录）细胞培养常用溶液和培养基制备?附录（资料性附录）遗传毒性试验用试剂制备?参考文献?犌 犅犜 前言本标准代替 医用有机硅材料生物学评价试验方法。本次修订按 医疗器械生物学评价 对标准内容进行了修改和调整。本标准与 的主要差异如下：增加了规范性引用文件；试验选择指南改为评价与试验选择，取消了试验选择表；修改了材料浸提液制备方法，取消了供试品表面积或重量与浸提介质比例表；修改了细胞毒性试验，包括浸提液和直接接触试验；过敏试验修改为迟发型超敏反应试验，增加了封闭贴敷迟发型超敏反应试验；将皮内刺激试验、原发性皮肤刺激试验和眼刺激试验整合为刺激试验，包括皮肤刺激试验、眼刺激试验和皮内反应试验。取消了口腔黏膜刺激试验；增加了亚急性（亚慢性）和慢性全身毒性试验；增加了遗传毒性试验，包括鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（试验）、小鼠淋巴瘤细胞突变试验和体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；修改了植入试验，增加了皮下和骨植入试验；增加了附录遗传毒性试验用试剂制备。本标准的附录和附录为资料性附录。本标准由国家食品药品监督管理局提出。本标准由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会归口。本标准起草单位：国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心、上海生物材料研究测试中心。本标准主要起草人：由少华、孙皎、朱雪涛、黄折曰玮、黄经春、王昕、侯丽、曾冬明。本标准于 年月首次发布。犌 犅犜 引言本标准给出的试验方法是根据 医疗器械生物学评价第部分：评价与试验 的基本原则，特别针对医用有机硅材料的生物学评价需求所设立的。本次修订是在 医疗器械生物学评价 标准和 中华人民共和国药典（以下简称 中国药典）二部中相应试验方法学原理和试验步骤的基础上，并根据医用有机硅材料的特性制定而成，因此本标准是与 标准和 中国药典 方法具有方法学等同性、适用于医用有机硅材料生物学评价的方法标准。本次修订对热原试验直接引用 中国药典 中的适用章节；对 标准中未给出详细试验步骤的试验项目进行了细化，例如细胞毒性、急性全身毒性、亚急性（亚慢性）和慢性全身毒性、遗传毒性和植入试验；对 标准中已详细给出试验步骤的刺激、迟发型超敏反应试验，本次修订采用直接引用相应 标准的方式。鉴于亚急性（亚慢性）和慢性全身毒性、遗传毒性试验均为发展中的生物学试验，本标准给出的试验方法并非为唯一的方法，任何经确认符合 标准基本试验原理且适用于医用有机硅材料的试验方法均可视为与本标准具有方法学等同性。犌 犅犜 医用有机硅材料生物学评价试验方法范围本标准规定了医用有机硅材料的生物学评价试验方法。本标准适用于医用有机硅材料的生物学评价。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。医疗器械生物学评价第部分：评价与试验（，：）医 疗 器 械 生 物 学 评 价第部 分：遗 传 毒 性、致 癌 性 和 生 殖 毒 性 试 验（，：）医疗器械生物学评价第部分：体外细胞毒性试验（，：）医疗器械生物学评价第部分：植入后局部反应试验（，：）医 疗 器 械 生 物 学 评 价第 部 分：刺 激 与 迟 发 型 超 敏 反 应 试 验（，：，）医疗器械生物学评价第 部分：全身毒性试验（，：）医疗器械生物学评价第 部分：样品制备与参照样品（，：，）中华人民共和国药典（二部）评价与试验选择 总则医用有机硅材料按其预期与人体接触的性质和接触时间按照 规定的基本原则进行生物学评价。试验选择 中给出了应考虑的评价试验。对于可能影响机体生殖功能的材料，应补充做生殖和发育毒性试验。样品制备 总则试验与对照样品制备应按 的要求进行。如果试验方案要求使用试验材料的浸提液，所用浸提介质和浸提条件应与最终产品的特性和使用以及试验目的相适应。在选择浸提条件时应考虑试验材料的理化特性、可溶出物或残留物。犌 犅犜 浸提条件如需制备浸提液，材料与浸提介质比例按 的规定。常规浸提条件见表。表常规浸提条件浸提温度浸提时间浸提设备 电热恒温培养箱 电热恒温培养箱 电热恒温培养箱 电热恒温干燥箱 电热蒸汽灭菌器注：（）浸提（）一般仅用于浸提介质为含血清细胞培养基时。细胞毒性试验 方法提要本试验系将试验样品接触培养细胞，通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观察，评价试验材料对体外细胞的毒性作用。注：也可采用其他等效的符合 要求的细胞毒性试验。试剂氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、葡萄糖、酚红、台盼蓝、乙二胺四乙酸二钠（）、胰蛋白酶、培养基、培养基、胎（小）牛血清、青霉素（钠盐）、硫酸链霉素、乙醇、苯酚、二甲基亚砜（）。主要设备和用具超净工作台、培养箱、恒温水浴箱、电冰箱、倒置显微镜、光学显微镜、压力蒸汽灭菌器、抽滤瓶、磁力搅拌器、培养板（皿）、液氮罐或超低温冰箱、天平。细胞株试验用细胞株可采用 （小鼠成纤维细胞）或其他适宜细胞。试验采用传代 生长旺盛的细胞。试验前准备 器具灭菌与试验和对照样品接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内 ，或置电热干燥箱内 。无菌室要求无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度 级单向流空气区域要求。细胞培养基、细胞消化液、平衡盐溶液制备按附录给出的方法或其他经确认适宜的方法制备。试验样品制备 无菌试验材料直接取样试验。未灭菌试验材料宜采用与成品相同的灭菌过程或其他适宜方法灭菌。需制备浸提液时可采用含血清（或无血清）细胞培养基或质量浓度为的氯化钠注射液为浸提介质，制备方法按 的规定。对照品制备 阴性对照品：可采用经确认过的不产生细胞毒性反应的材料，例如高密度聚乙烯。犌 犅犜 阳性对照品：可采用经确认过的可重现细胞毒性反应的材料，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯、质量浓度为的苯酚溶液或体积分数为的二甲基亚砜（）溶液。需制备浸提液时同 。试验步骤 总则根据试验材料特性选择下列试验中的一种或多种适宜方法进行评价。浸提液试验 四唑盐（犕犜 犜）比色法将配制好的 细胞悬液接种于 孔培养板，设置空白对照、阴性对照、阳性对照和试验样品组，每组各设至少孔，每孔接种 细胞悬液。置 培养箱（含体积分数二氧化碳气体，下同）培养 后，弃去原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性对照组加入阴性对照品浸提液，阳性对照组加入阳性对照溶液或阳性对照品浸提液，试验样品组加入试验材料浸提液，每孔 ，置 培养箱继续培养。注：如采用质量浓度为的氯化钠注射液为浸提介质时，需使用浓缩培养基将浸提液稀释至规定浓度。后，置显微镜下观察细胞形态。每孔加入 质量浓度为的 溶液，继续培养后弃去孔内液体，加入 ，置振荡器上振荡 ，在酶标仪 和 波长下测定吸光度，按式（）计算相对增殖率：犚 犌 犚犃犃 （）式中：犚 犌 犚 相对增殖率，；犃 试验样品组（阴性、阳性对照组）吸光度；犃 空白对照组吸光度。根据犚 犌 犚按表分级判定。阴性对照组的反应应不大于级，阳性对照组至少为级反应。如阴性对照组和阳性对照组反应不成立时应重新试验。表细胞毒性反应分级级别相对增殖率 显微镜观察法将配制好的 细胞悬液接种于直径 培养皿内，每皿。置 培养箱 培养至近汇合单层细胞形成。弃去原培养液。阴性对照组加入阴性对照品浸提液，阳性对照组加入阳性对照液或阳性对照品浸提液，试验样品组加入试验材料浸提液，每皿各加。每组平行操作皿，置 培养箱继续培养。注：如采用质量浓度为的氯化钠注射液为浸提介质时，需使用浓缩培养基将浸提液稀释到规定浓度。犌 犅犜 置显微镜下观察，按表分级判定。阴性对照组应为级反应，阳性对照组至少为级反应。如阴性对照组和阳性对照组反应不成立时应重新试验。表细胞毒性反应分级级别反应程度反应观察无细胞形态正常，贴壁生长良好，胞浆内有离散颗粒；无细胞溶解极轻微至多 的细胞呈圆形，疏松贴壁，无胞浆内颗粒；偶见细胞溶解轻度至多 的细胞呈圆形，无胞浆内颗粒；明显可见细胞溶解和细胞间空区中度至多 的细胞呈圆形或溶解重度细胞层几乎完全破坏 直接接触试验注：本试验不适宜于极低密度和高密度材料，可能会导致细胞物理性损伤。试验和对照材料应处置成直径为 的圆片或表面积约为 ，接触细胞面为平面。将配制好的 细胞悬液接种于直径 培养皿内，每皿。置 培养箱 培养至近汇合单层细胞形成。弃去原培养液，每皿加入 新鲜细胞培养基。将试验和阴性对照、阳性对照样品分别轻轻放入培养皿内，每皿放置一片样品，使其沉于皿底与细胞单层直接接触。每组平行操作皿。置 培养箱继续培养。置显微镜下观察，按表分级判定。阴性对照组应为级反应，阳性对照组至少为级反应。如阴性对照组和阳性对照组反应不成立时应重新试验。表细胞毒性反应分级级别反应程度反应观察无样品下面和周围区域细胞无异常迹象极轻微样品下面有些细胞出现形态异常或退化迹象轻度细胞反应区域局限在样品下方范围或超出样品边缘小于中度细胞反应区域超出样品下方范围 重度细胞反应区域超出样品下方范围 以上 结果评价在阴性对照和阳性对照产生预期反应的情况下，分析评价试验样品细胞毒性反应程度。试验报告试验报告中应给出下列信息：）试验材料名称；）批号；）试验和对照样品制备；）试验用培养基、细胞株制备；）试验步骤；）细胞反应和其他情况；）观察结果；）结果评价。犌 犅犜 迟发型超敏反应试验 方法提要本试验包括最大剂量迟发型超敏反应试验和封闭贴敷迟发型超敏反应试验，用以评价试验材料在试验条件下引发迟发型超敏反应的潜在性。总则最大剂量迟发型超敏反应试验为首选方法。试验样品如不适宜皮内注射或预期用于制造与皮肤接触器械的试验材料可选择封闭贴敷迟发型超敏反应试验。试剂质量浓度为的氯化钠注射液、新鲜精制植物油、二硝基氯苯（，）、十二烷基硫酸钠、弗氏完全佐剂。注：本标准各试验中所用新鲜精制植物油推荐采用符合美国药典规定的棉籽油或芝麻油，也可使用其他经验证证实无生物学毒性反应的植物油。主要设备和器具压力蒸汽灭菌器、电剃刀、天平、动物天平、注射器、研钵。试验前准备 器具灭菌与试验和对照样品接触的所有器具置压力蒸汽灭菌器内 。试验动物准备按 的规定。弗氏完全佐剂制备 无水羊毛脂与液体石蜡的体积比为（冬季使用比例为）。将无水羊毛脂加热溶解后取 置研钵中，稍冷却后边研磨边加液体石蜡，直至 液体石蜡加完。置压力蒸汽灭菌器内 ，即制备成弗氏不完全佐剂，保存备用。在弗氏不完全佐剂中按 加入死的或减毒的分枝杆菌（如卡介苗或结核杆菌），即得弗氏完全佐剂。最大剂量迟发型超敏反应试验 浸提介质质量浓度为的氯化钠注射液、新鲜精制植物油。阳性对照样品质量浓度为的二硝基氯苯溶液或其他能产生相应阳性反应的液体。试验样品制备按 规定选择适宜的浸提条件，每种试验材料制备质量浓度为的氯化钠注射液和植物油浸提液。试验步骤和结果评价按 的 进行操作和评价。封闭贴敷迟发型超敏反应试验 浸提介质质量浓度为的氯化钠注射液、新鲜精制植物油。阳性对照样品质量浓度为的二硝基氯苯溶液或其他能产生相应阳性反应的液体。试验样品制备按 规定制备试验样品。试验材料如不能直接贴敷，应按 规定选犌 犅犜 择适宜的浸提条件，每种试验材料制备质量浓度为的氯化钠注射液和植物油浸提液。试验