GBT 35901-2018 猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法.pdf

ICS 11.220B41GB中华人民共和国国家标准GB/T35901-2018猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法Real-time PCR method for detection of porcine circovirus type 22018-02-06发布2018-09-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布刮涂层查真伪GB/T35901-2018猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法1范围本标准规定了猪圆环病毒2型荧光PCR检测的操作方法。本标准适用于猪圆环病毒2型核酸检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T25172猪常温精液生产与保存技术规范3缩略语下列缩略语适用于本文件。荧光 PCR:荧光聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction)Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的值时所经历的循环数(cyclethreshold)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)Taq:Taq DNA酶(Taq DNA polymerase)TE缓冲液：Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTA buffer)PCV:猪圆环病毒(porcine circovirus)4仪器设备4.1荧光PCR检测仪。4.2高速台式冷冻离心机：可控温至4C、离心速度可达12000r/min以上。4.3普通冰箱：28。4.4普通冰柜：-20以下。4.5超低温冰箱：可控温至一70以下。4.6 微量移液器：0.2 L2 L、1 L10 L、10 L100 L、20 L200 L、100 L1 000 L,并配备与移液器匹配的吸头。4.7高压灭菌锅。5耗材5.11.5mL离心管。5.20.2mLPCR薄壁管或八联管。GB/T35901-20186试剂6.1除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。6.2DNAzol,商品化DNA抽提试剂，于2C8C保存。6.3无水乙醇，一20C预冷。6.475%乙醇，无水乙醇和双蒸水配制，-20预冷。6.58 mmol/L NaOH溶液，配见 A。6.6 PBS冲液(0.01 mol/L PBS,pH7.4),配见附录A。6.7Taq酶及 10倍 Taq酶应冲液：Taq酶浓度为 5 U/L,Taq酶反应冲液中Mg2+浓度为15mmol/L。6.8 dNTPs:含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各 10 mmol/L,-20C保存，避免反复冻融。6.9物和TagMan探针，其列附录B。6.10猪圆环病毒2型阳性对照样品和阴性对照样品：阳性对照使用灭活疫苗或组织培养灭活毒，-20C保存备用；阴性对照可采用健康猪的组织材料。6.11内参照质粒：带有人-珠蛋白基因的质粒7样品采集和处理7.1采样工具7.1.1手术刀、剪刀、镊子，经160C干热灭菌2h。7.1.2组织研磨器或者研，经160C千热灭菌2h。7.1.3真空采血管。7.2样品采集7.2.1血清样品采集：用无菌注射器抽取受检猪静脉血不少于5mL,置于无菌离心管内，室温或者37C倾斜放置自然凝集20 min30 min,2000r/min3000r/min离心10 min,吸取上清液到新的离心管内备用。7.2.2粪便样品采集：取猪新鲜粪便1g,装人15mL灭菌离心管中，加入5mLPBS,混匀。7.2.3精液样品采集：按照GB/T25172的方法采集和保存精液7.2.4组织样品采集：采取病死猪（包括流产的死胎）或扑杀猪主要脏器（淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏和肝脏)装入灭菌15mL离心管中，编号，送实验室。7.2.5细胞培养物：细胞培养物反复冻融3次，第3次解冻后，将细胞培养物置于1.5mL无DNA酶的灭菌离心管内，编号备用。7.3样品保存和运输上述采集的样品可立即用于检测。不能立即检测的样品，在28下保存应不超过24h,-20士5可以稳定保存3个月，-70以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行运输，并在规定温度下的保存期内送达。7.4样品处理7.4.1血清和精液样品无需进行前处理，直接用于核酸提取。7.4.2粪便样品：3000r/min离心10min,取上清液，转人1.5mL离心管中，用于后续的核酸提取。2GB/T35901-20187.4.3组织样品：取1g解冻的组织，剪碎，加人2 mL PBS进行研磨，制备组织匀浆，8000r/min离心5min,取上清用于后续的核酸提取。7.4.4细胞培养物：4000r/min,4离心10min,取上清用于后续的核酸提取。8荧光PCR操作程序8.1DNA抽提8.1.1在核酸提取区操作。DNA抽提使用DNAzol试剂提取，也可以使用等效商品化试剂盒提取。8.1.2取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数土阳性对照十阴性对照，对每个离心管进行编号。8.1.3每管先加入800LDWA20l,再分别加人被检样品、阳性对照、阴性对照各200L,颠倒10次混匀，4或室温10000r/nn离心0min。8.1.4取900L上清，置新的1.5mL灭菌离心管中，加入500L无水醇，混匀，室温放置3mi;4或室温10000y/min离心5min。8.1.5弃上清，沿詹壁缓缓加入0.8mL1mL75%乙醇，颠倒3次6次混匀410000r/min离心5mi。反复洗涤两次后将离心管倒和于吸水纸上自然晾王或用移液器移去残液。8.1.6用50L8mmol/LNaO溶液溶解沉淀DA在2c8C冰箱可保存两个月，20冰柜可稳定保存两年】8.2荧光PCR检8.2.1反应体系的配制在试剂配制区进行。设实时荧光卫CR反应管数为m,”为待检样品数阳性管数十阴性管数，每个反应的体系见附录C,为了避免移液器取样损失，建议按”个反应进行配通。配制反应液在冰盒中进行。8.2.2反应液的分装将8.2.1中配制的荧光PCR反应液充分混匀，按照每管39.8L分装于0.2mL透明PCR管内，将PCR管置于96孔板上，按顺序加样并做好标识，转移至核酸提取区。8.2.3加样在核酸提取区进行。在每个PCR反应管内加人0.2L的内参照质粒，并分别加入8.1制备的核酸10 uL DNA溶液，盖上盖子，500r/min1000rmin离心30s。转移至检测区。8.2.4上机检测8.2.4.1荧光通道设置在检测区进行。将8.2.3中离心后的PCR管放人荧光PCR检测仪内，设置探针：5选择FAM和HEX两个荧光通道，3均选择无(None)。8.2.4.2循环条件设置与检测第一阶段，预反应50/2min:第二阶段，预变性95C/2min;第三阶段，变性95/15s,退火、延伸、荧光采集60/30s,40个循环；