GBT 23197-2008 鸡传染性支气管炎诊断技术.pdf

ICS11.220B41GB中华人民共和国国家标准GB/T23197-2008鸡传染性支气管炎诊断技术Diagnostic techniques for avian infectious bronchitis2008-12-31发布2009-05-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T23197-2008前言本标准对应于OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册(2004)2.7.6鸡传染性支气管炎(avian infec-tious bronchitis),其一致性程度为非等效。在此基础上，根据国内科研成果增加了反转录-聚合酶链反应和气管环组织培养血清中和试验，用于病原的鉴定和抗体检测。本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、华南农业大学。本标准主要起草人：吴延功、廖明、王志亮、郭霄峰、刘佩兰、王永玲、孙承英。GB/T23197-2008于-20或-70低温冰箱保存。4.1.1.1.1组织样品的处理：往1g3g肺脏或肾脏等组织样品中加灭菌的0.85%生理盐水研磨成5倍10倍悬浮液，反复冻融2次3次后，以4000g离心10min,取上清液作核酸抽提用。4.1.1.1.2棉拭子的处理：将棉拭子充分捻动干后除去拭子，0.5mL样品液经4000g离心10min,取上清液作核酸抽提用。4.1.1.1.3细胞培养物：取1mL细胞培养物反复冻融2次3次后，以4000g离心10min后取上清液作核酸抽提用。4.1.1.1.4阴性尿囊液：10日龄SPF鸡胚尿囊液。4.1.1.1.5阳性病毒液：传染性支气管炎病毒M41株接种10日龄SPF鸡胚，孵育48h后收获的尿囊液。4.1.1.2异丙醇。4.1.1.3灭菌1.5mL离心管。4.1.1.4无RNA酶(RNase)水。4.1.1.5三氯甲烷（分析纯）。4.1.1.6无RNase水配制的75%乙醇溶液。4.1.2操作方法4.1.2.1取100L4.1.1中的上清液或尿囊液置于一灭菌的1.5mL离心管中，同时设立阴性尿囊液或阴性细胞培养液和传染性支气管炎病毒M41株阳性病毒液为对照，再分别加入900L冰冷的裂解液，剧烈混合样品15s,室温放置5min。4.1.2.2加入200L三氯甲烷，颠倒离心管混合2次，剧烈混合10s,4下以10000g离心15min。4.1.2.3吸取500L上层水相于新的1.5mL灭菌离心管中，加人500L异丙醇，4放置10min,4下以10000g离心15min。4.1.2.4小心弃去全部上清液，加入1mL无RNase水配制的75%乙醇溶液，上下轻缓颠倒两次，4下以7500g离心5min。4.1.2.5弃去全部上清，风干5min10min,即制得RNA。4.2反转录(RT)4.2.1材料准备4.2.1.1转录酶(reverse transcriptase)XL(AMV),核糖核酸酶抑制剂(RNasin)和反转录引物。反转录引物为6个碱基长度的随机引物，序列为5d(NNNNNN)3,其中N代表A或C或G或T四个碱基。4.2.1.2 10 mmol/L dNTPs.4.2.1.30.5mL灭菌PCR管。4.2.2操作方法4.2.2.1在一个洁净的0.5 mL灭菌 PCR管中依次加入5AMV缓冲液2L,10 mmol/L dNTPs0.5L,反转录引物20 pmol,核糖核酸酶抑制剂(RNasin)10 U.反转录酶AMV2.5U,用无RNase水补足总体积25L,轻缓混匀。4.2.2.2用4.2.2.1中的反转录混合液重悬4.1.2.5中制备的RNA,置于室温10min。4.2.2.3放人42水浴1h,取出冰浴2min,所得的反应液即为反转录产物cDNA。然后将cDNA置于一20保存或直接做PCR。4.3核酸扩增4.3.1材料准备4.3.1.1 Tag,2.5 mmol/L dNTPs,100 bp DNA分子质量标准。4.3.1.2PCR混合引物4PS:包括两对引物(Ms/Mx和3s/3x),分别针对传染性支气管炎病毒2GB/T23197-2008(IBV)基因组的M基因及基因组3末端的非编码区，这两个基因区间保守性强。在该混合引物中，Mx/Ms的引物浓度为4 pmol/L,3s/3x的引物浓度为5pmol/L。引物序列如下：-3s:5GGA AGA TAG GCA TGT AGC TT 3(20 nt);-3x:5CTA ACT CTA TAC TAG CCT AT 3(20 nt);-Ms:5CCT AAG AAC GGT TGG AAT 3(18 nt);-Mx:5TAC TCT CTA CAC ACA CAC 3(18 nt)4.3.1.30.5mL灭菌离心管。4.3.1.42.0%琼脂糖凝胶（含0.5g/mL溴化乙锭），其配制方法见附录A。4.3.2操作方法4.3.2.1在一个洁净的0.5mL灭菌PCR管中依次加人无RNase水18.5L,10PCR缓冲液2.5 L,2.5 mmol/L dNTPs 2 L,4PS PCR混合引物 1.5 L,2.5 U Taq酶0.5 L,轻缓混匀。4.3.2.2加人2L4.2.2.3中制备中的cDNA,轻缓混匀。4.3.2.3置于PCR仪中运行，94 3 min,94 40s,53 30s,72 30s,30个循环；72，7min。同时，设立以传染性支气管炎病毒M41株的cDNA为模板的阳性IBV病毒对照和阴性尿囊液或阴性细胞培养物的cDNA为模板的阴性对照。4.3.2.4PCR产物的检测：待PCR反应结束后，每个PCR样品取5L于含0.5g/mLEB的2.0%琼脂糖凝胶孔中电泳，同时加入5L标准100bpDNA分子量标准物作为参照。在75V恒压电泳30min,取凝胶置于紫外灯下观察或成像。4.4检测与判定4.4.1阳性对照在约740bp和290bp处分别有一条特异的DNA条带，阴性对照则无相应的特异条带出现，则实验成立。4.4.2待检样品在相应位置如出现特异性条带，或者仅在约740bp出现条带或者仅在约290bp处出现特异条带，则均可判为阳性。4.4.3如果需要进一步验证的话，可将获得的大小约为740bp或290bp的PCR产物回收纯化后测序，将测序结果提交美国国家生物技术信息中心(NCBI)进行BLAST分析。如果BLAST结果显示：大小约为740bp的测定序列与基因数据库(GenBank)中注册的IBV膜蛋白序列同源性最高，或者大小约为290bp的测定序列与GenBank中注册的IBV基因组3末端序列同源性最高，则进一步确证检测结果阳性。5微量血凝抑制试验5.1准备5.1.1器材5.1.1.1微量反应板：96孔，V形底，同一次试验使用的反应板孔底角度应相同。5.1.1.2塑料采血管：内径2mm,长10cm。5.1.2试剂5.1.2.1稀释液：pH7.4磷酸缓冲盐水(PBS)。5.1.2.2浓缩抗原：由指定单位提供，按说明书使用，置4保存。5.1.2.3标准阳性血清：由指定单位提供，按说明书使用。5.1.2.4阿氏液(Alsever),配制方法见附录A。5.1.2.51%鸡红细胞悬液：采不少于3只健康成年鸡血液，以1：2的比例与阿氏液混匀，用20倍量PBS洗涤3次4次，每次以1500g离心5min,最后一次10min,用PBS配成体积分数为1%的悬液。5.1.3被检血清刺破鸡羽下静脉，用毛细塑胶管引进血流6cm8cm长，烧融一端，镊夹封口。血液凝固析出血清3