BCL11A在神经细胞中稳定低表达对智能障碍风险基因的转录调控机制.pdf

Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期278网络出版地址：https：/ 发育与再生四川省重点实验室组织胚胎学教研室（成都 610500）；2.成都医学院 病理学与病理生理学教研室（成都 610500）【摘要】目的探究稳定敲降BCL11A对神经发育关键因子的表达影响。方法设计并筛选靶向人源BCL11A的shRNAs，通过慢病毒构建能稳定敲降BCL11A的人神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y细胞）。首先，利用逆转录荧光定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质印迹技术实验体外验证BCL11A的敲降效果，RT-qPCR实验探索BCL11A敲降后皮质发育关键转录因子的表达变化，进而利用转录组测序分析BCL11A敲降后差异基因的富集情况，最终通过染色质免疫共沉淀（ChIP）实验验证差异基因启动子的转录活性标志pPol以及染色质活性修饰H3K9ac的变化。结果BCL11A敲降后神经元特异转录因子GRM7、BCL11B、CTCF、ADCYAP1R1、NeuroD1/2、PAX6、SATB1/2的表达降低；皮质神经元关键转录因子GRIN1、TCF12、MEF2D的表达升高。转录活性标志pPol以及染色质活性修饰H3K9ac在GRM7启动子的富集度降低，在GRIN1启动子的富集呈现升高趋势。结论转录因子BCL11A表达缺失可影响智能障碍相关转录因子的转录活性与表达变化。【关键词】慢病毒；BCL11A；CRISPR/Cas9；神经系统【中图分类号】Q291【文献标识码】ATranscriptional Regulation Mechanisms of Stable BCL11A Knockdown in Neuron on Risk Genes of Intellectual DisabilityTang Xiaohan1，2，Chen Jinrong1，Su Bingyin1，Li Shurong1，2，Xie Xuemin1.1.Department of Histology and Embryology，Key Laboratory of Development and Regeneration of Sichuan Province，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；2.Department of Pathology and Pathophysiology，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of stable knockdown of BCL11A on the expression of key factors in neurodevelopment.Methods shRNAs targeting human BCL11A were designed and screened.Human neuroblastoma cell line（SH-SY5Y cells）that could stably knock down BCL11A was constructed by lentivirus.The knock-down effect of BCL11A was verified in vitro by reverse-transcription quantitative polymerase chain reaction（RT-qPCR）and Western blotting（WB）.The expression changes of key transcription factors in cortical development after BCL11A knockdown were detected by RT-qPCR.The enrichment of differential genes after BCL11A knockdown was analyzed by transcriptome sequencing.The changes of the transcriptional activity marker pPolII and the chromatin modification factor H3K9ac of the differential gene promoters were verified by chromatin immunoprecipitation（ChIP）.ResultsAfter BCL11A knockdown，the expressions of neural-specific transcription factors GRM7，BCL11B，CTCF，ADCYAP1R1，NeuroD1/2，PAX6 and SATB1/2 were down-regulated，while the expressions of key transcription factors GRIN1，TCF12 and MEF2D in cortical neurons were up-regulated.The enrichment of the transcriptional activity marker pPolII and the chromatin modification factor H3K9ac were down-regulated in GRM7 promoter while up-regulated in GRIN1 promoter.Conclusion Stably down-regulated BCL11A leads to changes in transcriptional activity and expression of transcription factors related to intellectual disability.【Key words】Lentivirus；BCL11A；Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR/Cas9）；Nervous system*基金项目：四川省科技厅应用基础研究重点项目（No：2021YJ0018，No：2019YJ0366，No：2021YJ0169）；成都医学院发育与再生四川省重点实验室基金重点项目（No：SYS18-01）通信作者：李淑蓉，解学敏 Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期279BCL11A基 因 座 位 于 人 类 染 色 体 2p16.1，编 码krppel样锌指蛋白1。BCL11A在血液和神经组织中呈高表达，可调节血红蛋白的转化并介导B细胞恶性肿瘤的发生2。BCL11A是皮质发育所必需的关键因子3，在皮质发育过程中，BCL11A调控神经元从多极形态到双极形态的转换，从而参与深层皮质中的投射神经元形成4-5。BCL11A缺陷的神经元表现为辐射迁移受损和Semac3c的过表达，进而参与调节智能障碍（intellectual disability，ID）关联基因TBR1在皮质中的表达，导致ID6。ID的临床表现为进行性的认知能力受损，伴随适应社会环境能力的严重缺陷，其全球发病率高达237，病因多源于遗传因素。遗传性ID受蛋白表达、DNA碱基修饰、染色质共价和非共价变化等多种转录以及表观遗传调控8。临床报道9显示，BCL11A基因座的缺失会介导 2p15-p16.1缺失型ID发生，并伴有持续性胎儿血红蛋白升高。2p15-p16.1微缺失综合征是一种特殊类型的遗传性ID，其临床表现为中至重度ID、自闭症、小头畸形以及包括皮质在内的大脑结构异常等特征10。然而，BCL11A在神经发育中的调控方式及参与 2p15-p16.1 微缺失综合征的具体机制尚需进一步阐释。前期研究11证实，BCL11A主要在小鼠胚胎 13.5 d 的大脑皮质表达，并通过设计siRNA瞬时敲降BCL11A，致使细胞转录活化水平整体下降，初步证明BCL11A在胚胎皮质发育过程中具有转录激活作用。为了进一步探索BCL11A如何参与神经组织的表观遗传调控，本课题组在此基础上，首先通过慢病毒载体构建能长期、稳定敲降BCL11A的细胞株，并利用实时荧光 定量PCR（reverse-transcription quantitative PCR，RT-qPCR）和蛋白质印迹技术，探索BCL11A对皮质发育关键转录因子的表达影响，继而转录组测序分析BCL11A敲降后差异基因的富集情况，最终通过染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）验证差异基因启动子的染色质活性变化，从而初步揭示BCL11A在神经细胞中对ID风险基因的转录调控机制。1材料与方法1.1实验细胞293T细胞系（人肾上皮细胞系）来源于人胚肾细胞、SH-SY5Y细胞系（人神经母细胞瘤细胞系）来源于人神经母细胞，均为本实验室冻存细胞。1.2试剂与仪器 1）主要试剂：蛋白质印迹技术整套试剂（上海碧云天）、蛋白酶抑制剂（北京擎科）、RIPA裂解液（上海碧云 天）、anti-Ctip1抗 体（上 海Abcam）、anti-actin抗体（上 海Abcam）、anti-GAPDH抗 体（上 海Abcam）、anti-BCL11A抗体（上海 Abcam）、pPol（上海Abcam）、H3K9ac（上海Abcam）；opti-MEM 培养基和达尔贝科 极限必需培养液（Dulbecco minimum essential medium，DMEM）/F12（美国Gibco）、DMEM培养基（美国Gibco）、0.25胰酶及胎牛血清（美国Gibco）；抗生素-抗真菌（美国 Thermo）、聚凝胺（北京Solarbio）、TRIzol（美国Thermo）、逆转录RT-qPCR试剂盒（北京Trans Gen Biotech）。2）主要仪器：Olympus SZX2-ILLT荧光显微镜（日本Olympus）、PCR核酸扩增仪（美国Bio-Rad）、CO2培养箱（美国Thermo）、倒置荧光显微镜（日本 Nikon）、台式低温离心机（美国Thermo）、RT-qPCR 仪 及CFX96TM Real-time system（美国Bio-Rad）。1.3实验方法1.3.1细胞的培养与传代细胞复苏后，在 37、5 CO2 条件下，使用完全培养基（10 Gibico胎牛血清+1抗真菌抗生素）培养HEK293T、SH-SY5Y细胞，每 12 d采用 1PBS轻柔清洗后，更换 1次培养基，细胞汇合度达 80左右时进行传代。1.3.2shRNA慢病毒质粒的构建及病毒收集在NCBI网站上下载人源BCL11A基因的全长序列，设计5组慢病毒序列（表 1）。PCR扩增目的片段后，引物退火连接目标片段，待感受态细胞为冰水混合状态时进行转化连接产物，然后在 37 培养箱中过夜培养。第2天挑选克隆于 37 培养箱中，220 r/min摇晃过夜培养后，提取质粒测序鉴定。表 1慢病毒引物序列引物名称引物序列shhsB1-FccggacagaacactcatggattaagctcgagcttaatccatgagtgttctgttttttgshhsB1-RaattcaaaaaacagaacactcatggattaagctcgagcttaatccatgagtgttctgtshhsB2-Fccggacctctccatgggattcatatctcgagatatgaatcccatggagaggttttt