人参皂苷Rg1促进人牙龈成纤维细胞增殖、迁移及成骨分化的研究.pdf

812安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)网络出版时间：2023-04-21 11：21：45 网络出版地址:h t t ps：/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1340.018.h t ml人参皂甘Rgl促进人牙龈成纤维细胞增殖、迁移及成骨分化的研究张 昕巴李长顺2,刘 浩2侏绍跃2,周 猛2,冯 岩2,张光东I摘要 目的 探讨人参皂昔Rg l（GsRg l）对人牙龈成纤维 细胞（HGFs）增殖、迁移及成骨分化的影响及分子机制。方 法采用组织块法分离培养HGFs,并进行形态学和免疫荧 光鉴定;取第3代HGFs,CCK-8法检测6种浓度的GsRg l（0,6.25、12.5、25、50、100 mg/L）对 HGFs 增殖的影响;Tr a nsw el l 实验检测不同浓度GsRg l对HGFs迁移能力的影响;碱 性磷酸酶（ALP）染色检测成骨能力;茜素红染色观察并定量 钙结节；q RT-P CR检测COL-1、OCN和OP N成骨基因表达;West er n bl o t 检测 0CN、0P N 和 COL-1 以及 P I3K/AKT 信号 通路相关分子的蛋白表达情况。结果与对照组比较，浓度 为12.5、25、50、100 mg/L GsRg l可明显提高HGFs增殖能力（P 0.05）,其中100 mg/L GsRg l促增殖作用最强,6.25 mg/L GsRg l组与对照组比较差异无统计学意义;GsRg l处 理后HGFs迁移能力增强，且呈浓度依赖。与对照组比较,100 mg/L GsRg l组ALP活性明显增加（P 0.01）；茜素红染 色钙结节定量明显增多（P 0.01）；成骨相关基因OCN、0P N和COL-1的mRNA和蛋白表达水平升高（P 0.05）；p-P I3K、p-AKT蛋白表达水平随时间上调明显（P0.05）,而 P I3K、AKT蛋白表达水平无明显变化。结论 GsRg l可以促 进HGFs增殖和迁移,100 mg/L GsRg l能够促进HGFs的成 骨分化，可能与激活P I3K/AKT信号通路有关。关键词 人牙龈成纤维细胞;人参皂昔Rg l;细胞增殖;细胞 迁移;成骨分化中图分类号 R 781.42文献标志码A 文章编号1000-1492（2023）05-0812-08 d o i:10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.018人牙龈成纤维细胞（h u ma n g in g iv a l f ibr o bl a st s,2022-12-31 接收基金项目:江苏省自然科学基金（编号:BK20191347、BK20210080）；江苏省高校优势学科建设工程项目（编号：2018-87）；徐州 市卫生健康委科技项目（编号:XWKYSI20220135）作者单位J南京医科大学附属口腔医院综合科，江苏省口腔疾病研 究重点实验室,江苏省口腔转化医学工程研究中心,南京 2100292徐州医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，徐州221002 作者简介:张昕，女,硕士研究生；张光东，男，主任医师，硕士生导师，责任作者,E-ma il:eg d-zh a n g n jmu.ed u.c nHGFs）是牙周组织工程常用的种子细胞。已证实 HGFs具有多向分化的潜能，可在不同诱导条件下 分化为骨细胞、平滑肌样细胞以及内皮样细胞 等。人参是一种传统中药材，人参皂昔Rg l（g in-sen o sid e Rg l,GsRg l）是其主要活性成分之一，具有 抗炎、抗氧化等功能。研究发现GsRg l可调控 间充质干细胞（mesen c h y ma l st em c el l s,MSCs）的增 殖、分化、衰老、凋亡，从而影响机体组织修复。Yin et a l研究发现,GsRg l可促进牙周膜干细胞（per io d o n t a l membr a n e st em c el l s,P DLSCs）增殖，增加碱 性磷酸酶（a l k a l in e ph o sph a t a se,ALP）的活性及骨桥 蛋白（o st eo po n t in,OP N）和骨钙素（o st eo c a l c in,OCN）等蛋白的表达，从而促进P DLSCs的成骨向分化。然而GsRg l对HGFs增殖、迁移以及成骨机制的研 究尚未见报道。因此，该研究探讨GsRg l对HGFs 增殖、迁移的影响，并验证GsRg l对HGFs成骨方向 分化的影响,初步探索其可能的作用机制，为GsRg l 用于牙周组织修复再生及牙周病的治疗提供了实验 依据。1材料与方法1.1材料与试剂GsRg l单体（纯度98%,微科曼 得生物工程有限公司）;DMEM高糖培养基、DAP I 染色试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；胎 牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；I型 胶原蛋白酶、Dispa se U（美国Gibc o公司）；CCK-8 试剂盒、Tr it o n X-100、正常山羊血清、青-链霉素双 抗（微科曼得生物工程有限公司）；Vimen t in抗体、Cy t o k er a t in l 7抗体、488荧光标记红色山羊抗兔子 Ig G（美国P r o t ein t ec h公司）；Tr a n sw el l过滤器培养板（美国BD公司），倒置光学显微镜（日本Nik o n公 司）；磷酸盐缓冲液（上海碧云天生物技术有限公 司）；0,25%胰酶细胞消化液（微科曼得生物工程有 限公司）；兔抗P-a c t in抗体、兔抗P I3K抗体、兔抗p-P I3K抗体、兔抗AKT抗体、兔抗p-AKT抗体（上海 碧云天生物技术有限公司）；兔抗OCN抗体，兔抗I 型胶原蛋白（c o l l a g en-I,COL-I）抗体，兔抗OP N 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)813抗体（美国Abea m公司）。1.2方法1.2.1 HGFs的提取与培养 徐州医科大学附属口 腔医院口腔颌面外科门诊选取18 22周岁健康成 年患者因正畸需要拔除前磨牙或第三磨牙，已获得 供者本人知情同意，牙齿无頗坏、牙髓炎、牙周炎等 疾病,牙齿周围牙龈质地及色泽正常,无炎症肿胀。行拔除术前以75%乙醇充分消毒牙体周围组织，切 取拔牙创周围的牙龈组织，立即置于含双抗的预冷 DMEM中,迅速转移到实验室。在超净工作台内，用含双抗的P BS冲洗3次 后,将组织块剪成1 3 mn?的大小，采用胰酶消化 法,37弋下水浴锅中消化组织2 h,然后加入含20%血清的DMEM培养液终止消化，离心去除上清液后 再次加入含20%血清的DMEM培养液，吹打均匀后 将细胞悬液放入培养皿中，置于37弋、5%CO?培 养箱中培养，每3 d换液1次。当细胞融合至80%90%后,弃培养液,P BS清洗，用0.25%胰蛋白酶 消化5 min得到细胞悬液，离心去上清夜，重新加入 含20%血清的DMEM培养液重悬细胞，传代获得实 验用细胞，取第3代HGFs进行实验。该项目由徐 州医科大学附属口腔医院伦理委员会批准、审査（批准号：202009014）。1.2.2 HGFs的免疫荧光鉴定 将第3代HGFs以 3 xKT个/ml密度均匀接种于24孔板中的爬片上,待细胞铺满爬片约60%时弃去培养液;用4%的多 聚甲醛固定爬片15 min,干燥后P BS液洗涤;然后 0.5%Tr it o n X-100室温通透20 min；爬片上滴加正 常山羊血清，室温封闭30 min以减少非特异性背景 着色;加一抗鼠抗人波形丝蛋白（Vimen t in）抗体、鼠抗人细胞角蛋白（CK）抗体4咒孵育过夜;次日 复温30 min后加山羊抗兔二抗于37兀湿盒内避光 孵育1 h；用DAP I处理30 min后P BS液冲洗3遍，封片。用荧光显微镜采集细胞图像。1.2.3 不同浓度GsRg l溶液配置 取20 mg GsRg l粉末，用含10%FBS的DMEM培养液配置浓 度为100 mg/L的GsRg l溶液，然后按比例稀释，配 成含 0、6.25、12.5、25、50、100 mg/L 的 GsRg l,10%FBS的DMEM培养液，长期低温密封保存。1.2.4 CCK-8法检测GsRg l对HGFs增殖的影响 取生长良好的第3代HGFs,配制浓度为4 x 104 个/ml的单细胞悬液，以每孔100 pu l接种于96孔培 养板中，置于37七、5%C02培养箱中预培养24 h,换液，每孔加入100|x l不同浓度（0、6.25、12.5、25、50、100 mg/L）的GsRg l,0 mg/L为阴性对照，每个 浓度设5个复孔，置于37弋、5%C02培养箱中继 续培养。分别于2,24 h后，按照CCK-8法说明书进 行操作，每孔加入10|11的CCK-8,将培养板在培养 箱中孵育2 h,用酶标仪测定在450 n m处的吸光度。1.2.5 Tr a n sw e l l实验检测GsRg l对HGFs迁移的 影响 取生长良好的第3代HGFs细胞，配制浓度 为1 X105个/ml的单细胞悬液，经血清饥饿12 h 后,以每孔100|x l接种于Tr a n sw el l上室，下室置入 500|jl1 1%胎牛血清a-MEM培养基，分别用0、6.25、12.5、25、50、100 mg/L GsRg l 处理细胞，然后 分别于6、8、12、24 h后将下室经甲醛固定30 min,0.1%结晶紫染色并在倒置显微镜下观察计数小室 下表面的活细胞数。1.2.6 ALP活性检测 取生长良好的第3代HGFs 细胞,经胰蛋白酶消化计数，将HGFs密度调整为2 X104个/ml,接种在24孔板内，待细胞贴壁80%后，实验分组:实验组加入100 mg/L GsRg l处理，对 照组0 mg/L GsRg l处理。培养4、7 d后,吸出原有 培养基,P BS洗涤3次,接着用4%多聚甲醛固定30 min,P BS洗涤，随后每孔加入配制好的ALP显色剂 避光染色30 min,P BS洗涤后用光学显微镜观察并 拍摄图像。为了检测ALP活性的定量表达，细胞培养4、7 d后,P BS冲洗，每孔加入100|x l 1%曲拉通X-100,置于冰上裂解30 min,反复吹打后收集裂解液。裂 解液置于冷冻离心机4兀温度下，以12 000 r/min 的转速离心10 min,吸取上清液。根据BCA蛋白定 量试剂盒的说明，测定上清液的总蛋白浓度，并根据 ALP活性检测试剂盒的说明，计算样品的ALP活 性。1.2.7茜素红染色 取生长状态良好的第3代 HGFs,胰蛋白酶消化计数后，将HGFs密度调整为2 X104个/ml接种在6孔板中，待细胞贴壁生长至 80%时,去除培养液,实验分组:对照组仅添加成骨 诱导培养液（含 10%FBS 的 a-MEM、0.05|x g/L L-抗坏血酸磷酸、10 mmo l/L 3-甘油磷酸、10 n mo l/L 地塞米松），实验组分别添加浓度12.5、100 mg/L GsRg l的矿化诱导培养液，分别培养14 d,吸去原培 养液,P BS漂洗3遍。每孔加入1 ml的4%多聚甲 醛固定40 mino吸去固定液,P BS洗涤。每孔加入 1 ml茜素红染色液，染色5 mino吸去染色液,P BS 反复漂洗至液体颜色不变红。室温烘干，倒置显微 镜下观察并拍照记录各组培养皿表面钙结节的染色 814安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)情况。采集图像后,6孔板每孔加入CP C处理10 min,收集液体样本,测定0D值。1.2.8 成骨相关基因表达的检测 将HGFs以