去铁胺诱导的自噬增加线粒体...MDA-MB-231的迁移_杜佩珊.pdf

生物医学工程学进展2023 年第 44 卷第 2 期 生物材料与分子生物学 128 doi:10.3969/j.issn.1674-1242.2023.02.003 去铁胺诱导的自噬增加线粒体内铁的含量并促进 三阴性乳腺癌细胞 MDA-MB-231 的迁移 杜佩珊，王士成，刘苹（上海交通大学生物医学工程学院，MED-X 研究院，上海 200030）【摘要】癌细胞转移是乳腺癌患者死亡的主要原因，铁代谢异常造成的铁超载能促进乳腺癌细胞的增殖和迁移。去铁胺（DFO）是被广泛使用的铁螯合剂，能抑制多种肿瘤细胞的增殖，降低雌激素受体（ER）阳性人类乳腺癌细胞中的铁含量，但增加了三阴性乳腺癌（TNBC）细胞中的铁含量。此外，DFO 可以增加线粒体内铁的含量，然而线粒体内铁的来源尚不清楚。该研究通过免疫荧光、蛋白质印迹及电感耦合等离子质谱，分析侵袭性乳腺癌 MDA-MB-231 和非侵袭性乳腺癌 MCF-7中的铁代谢和自噬相关蛋白，利用自噬抑制剂探究线粒体铁增多的机制。该研究发现，DFO 能通过诱导铁蛋白自噬促进线粒体内铁积累增加，从而促进 TNBC 细胞的上皮-间质转化与迁移。经过 DFO 处理，线粒体钙离子单向转运蛋白（MCU）和线粒体铁转运蛋白 1（Mfrn1）可能参与了铁从细胞质向线粒体的转运。该研究为临床中探寻新的靶向铁代谢治疗三阴性乳腺癌的方式提供了研究基础。【关键词】去铁胺；自噬；铁；三阴性乳腺癌【中图分类号】R730.231，Q28 【文献标志码】A 文章编号：1674-1242（2023）02-0128-11 Deferoxamine-induced Autophagy Increases Mitochondrial Iron Content and Promotes Cell Migration in Triple-Negative MDA-MB-231 Cells DU Peishan,WANG Shicheng,LIU Ping(MED-X Research Institute,Shanghai Jiao Tong University School of Biomedical Engineering,Shanghai 200030,China)【Abstract】Cancer cell metastasis is a major cause of death for breast cancer patients,and iron overload due to abnormal iron metabolism could promote proliferation and migration of breast cancer cells.The deferoxamine(DFO)is widely used,which inhibits the proliferation of tumor cells and decreases the iron content in estrogen receptor(ER)-positive human breast cancer cells but increases the iron content in triple-negative breast cancer(TNBC)cells.In addition,DFO could increase the iron content of mitochondria.However,the source of iron in mitochondria remains unclear.Iron metabolism and autophagy-related proteins in aggressive breast cancer MDA-MB-231 and nonaggressive breast cancer MCF-7 were examined by immunofluorescence,western blot and inductively coupled plasma-mass spectrometry.The possible regulatory mechanism of increased mitochondrial iron was explored by autophagy inhibitor.In this study,we found that iron content in mitochondria was due to the degradation of Ferritin by DFO-induced autophagy,which was essential for DFO-induced increase in cell epithelial mesenchymal transition and cell migration.收稿日期：2023-03-08。基金项目：国家自然科学基金（81571729，82072085）。作者简介：杜佩珊（1998），女，四川省成都市人，硕士研究生，从事肿瘤学研究工作。通信作者：刘苹，女，教授，博士生导师，电话（Tel.）：021-62933231，E-mail：。生物医学工程学进展2023 年第 44 卷第 2 期 生物材料与分子生物学 129 Moreover,the increased level of mitochondrial calcium uniporter(MCU)and mitoferrin1(Mfrn1)might be involved in the DFO-induced increase of iron content in mitochondria.The study provides a research base for exploring new approaches to target iron metabolism for triple negative breast cancer in the clinic.【Key words】Deferoxamine(DFO);Autophagy;Iron;Triple Negative Breast Cancer 0 引言 癌细胞转移是造成乳腺癌患者死亡的主要原因1。与正常细胞相比，乳腺癌细胞中铁代谢异常，这可能会促进肿瘤的发生和转移2。铁是一种重要的无机金属元素，是参与核酸代谢和修复及细胞周期进程的多种蛋白质的关键组成成分，对细胞的增殖、生长和代谢至关重要3。然而，过量的铁积累会导致 DNA 氧化损伤，对细胞的正常活性有剧毒，因此，铁的稳态代谢对维持细胞正常的生理功能尤为重要4。在正常生理状态下，转铁蛋白（Transferrin，Tf）通过与其受体（TfR1）结合，将循环中的铁运送到细胞内。二价金属离子转运蛋白 1（DMT1）位于细胞膜表面，主要参与细胞外亚铁离子的运输5。利用后的铁或细胞内储存的过量铁可以通过铁泵蛋白（Ferroportin，FPN）排出细胞。FPN 是目前哺乳动物体内唯一已知的铁外排蛋白，在维持细胞铁稳态方面具有关键作用6。肿瘤的主要特征之一是肿瘤细胞过度增殖，这使它们比正常的细胞更依赖铁元素4。乳腺癌细胞中的铁代谢失调反映在铁调节蛋白表达的改变上。TfR1 在乳腺癌细胞系和人类乳腺癌样本中都高度表达，而 FPN在乳腺癌细胞系和人类乳腺癌样本中表达下调7,8。铁吸收的增加与外流的减少导致铁在乳腺癌细胞中过量积累。研究表明，乳腺癌组织中铁储存蛋白（Ferritin）的水平和铁浓度明显高于正常乳腺组织9-13。铁超载可能诱导肿瘤的发生，促进肿瘤的增殖与转移，导致新生血管的形成，也与乳腺癌细胞获得更强的恶性表型高度相关。因此，使用铁螯合剂或 TfR1 阻断抗体调控铁代谢已成为肿瘤治疗的重要方式14。铁螯合剂最初被用于治疗铁超载性疾病，如骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血等。有研究表明，铁螯合剂已成为干预肿瘤发展和远端转移的有效策略15。铁螯合剂可以通过诱导细胞周期停滞、促进细胞凋亡来抑制细胞增殖，并同时参与抑制血管生成，从而抑制肿瘤转移16。去铁胺（Deferoxamine，DFO）对铁具有极高的亲和力，是第一个被用于治疗恶性肿瘤的铁螯合剂17。DFO 可以抑制多种肿瘤细胞的增殖，如乳腺癌细胞、肝癌细胞等18-20。然而，DFO 诱导的铁耗竭也被报道具有促进缺氧诱导因子-1（HIF-1）和血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Facter，VEGF）表达的作用，从而促进肿瘤转移21,22。本课题组以前的研究也表明，DFO 通过激活TNBC 乳腺癌细胞系中的 IL-6/PI3K/AKT 途径上调细胞内的铁含量，并通过增强 TNF-依赖性的 NF-B 信号传导和 TGF-信号传导，使 TNBC 细胞具有更强的细胞迁移能力23,24。此外，DFO 也能促进线粒体内铁含量的增加23。有文献报道，线粒体在铁代谢中起核心作用，细胞内的铁会被运送到线粒体以用于辅因子的合成、DNA 的合成和修复，以及其他各种细胞生命活动25。然而，目前对于经过 DFO 处理后高度侵袭性乳腺癌细胞线粒体内铁含量增加的机制仍不清楚。细胞中的铁以无毒的形式储存在铁蛋白中，铁蛋白最多能储存 4500 个铁原子26。在缺铁的条件下，铁蛋白在溶酶体中通过自噬途径被降解，该过程被称为铁自噬26。核受体共激活因子 4（NCOA4）是铁自噬的重要蛋白，它与铁蛋白结合并将其递送至溶酶体内以完成降解26。然而，目前尚不清楚 DFO 诱导的线粒体中铁含量的增加和细胞迁移能力的增强是否依赖自噬。本研究使用三阴性乳腺癌细胞系（MDA-MB-231细胞）和 ER 阳性乳腺癌细胞系（MCF-7 细胞）作为细胞模型，探究经过 DFO 处理，线粒体铁增加的机制。本研究揭示了 DFO 诱导的自噬是导致铁蛋白降解的重要机制，从而促进线粒体内铁的积累，上调铁含量，并促进上皮-间质转化相关蛋白的表达，最终增强细胞的迁移和侵袭能力。因此，联合使用自噬抑制剂能有效缓解由 DFO 治疗导致的三阴性乳腺癌细胞上皮-间质转化和迁移增多，并可以作为未来治疗乳腺癌的新方案。1 实验材料和实验方法 1.1 细胞培养 非侵袭性 ER 阳性乳腺癌细胞系（MCF-7 细胞）生物医学工程学进展2023 年第 44 卷第 2 期 生物材料与分子生物学 130 和侵袭性三阴性乳腺癌细胞系（MDA-MB-231 细胞）购于美国标准生物品收藏中心，用含有10%FBS（胎牛血清，Gemini，加利福尼亚州，美国）和 100 活力单位/mL 青霉素及 0.1mg/mL 链霉素（Hyclone，犹他州，美国）的 DMEM 培养基（Cytiva，马萨诸塞州，美国）培养。细胞培养于 37的具有 5%CO2的潮湿环境。1.2 全细胞蛋白提取 肿瘤细胞用 10M 氯喹（CQ，Sigma，密苏里州，美国）预处理 1 小时，随后用 200M DFO（Sigma，密苏里州，美国）处理 24 小时。将收集到的细胞在含有 1mM 苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl Fluoride，PMSF）的 RIPA 裂解缓冲液（Millipore，马萨诸塞州，美国）中裂解，添加蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂。离心后，收集上清液，用 BCA 蛋白检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国）测定蛋白浓度。1.3 线粒体和线粒体蛋白提取 收集肿瘤细胞，用线粒体提取试剂盒（碧云天，上海，中国）提取线粒体。简言之，将肿瘤细胞重悬于添加了 1mM PMSF 的线粒体分离试剂中，冰浴 1015 分钟。将细胞悬液转移至匀浆器中进行研磨，用台盼蓝染色液鉴定匀浆效果。处理好的细胞悬液在800g、4的条件下离心 10 分钟。随后收集上清液，在11000g、4的条件下离心 10 分钟，弃上清液，收集沉淀部分。随后使用线粒