人结节型皮肤基底细胞癌病变...胞株中视蛋白3的表达及功能_许佳.pdf

基础研究人结节型皮肤基底细胞癌病变组织和细胞株中视蛋白 的表达及功能许佳，韩宁，章俊，兰应华，辜阳广，罗欢欢，杨玉麟，汪宇，陆洪光（贵州医科大学 临床医学院 皮肤病与性病学教研室，贵州 贵阳；贵州医科大学附属医院 皮肤科，贵州 贵阳）摘 要目的 探讨人结节型皮肤基底细胞癌（）病变组织及细胞株中视蛋白（）的表达及功能。方法 选取 例结节型 患者病灶组织及相邻癌旁正常组织（）分别作为病灶组及 组，采用免疫荧光染色法检测 的表达，及实时荧光定量（）分别检测 组标本组织中 蛋白及 的表达；取对数生长期的人 细胞株，分为对照（）组、空白（）组及实验（）组，并设计针对人 的小干扰 转染 细胞，采用 （）检测 下调后、及 组及 组的细胞增殖活性，采用 迁移和细胞划痕实验检测 下调 后 组细胞的迁移能力，采用流式细胞术和 分别检测 下调 后 组细胞凋亡数量及钙通道相关蛋白环磷腺苷效应元件结合蛋白（）、磷酸化（）、钙调蛋白依赖激酶（）、磷酸化（）的表达。结果 与 组比较，病灶组 组织中 表达增高（.）；下调 后 ，组 细胞增殖活性较 组下降（.）；下调 后 ，与 组相比，组 细胞迁移能力降低（.），细胞凋亡细胞数量增加（.），细胞钙通道相关蛋白 和 表达下降（.）。结论 在人结节型 组织中高表达，可调控人 系 细胞的增殖、迁移及凋亡，其机制可能与钙依赖 蛋白偶联受体（）信号通路有关。关键词细胞增殖；细胞凋亡；视蛋白；蛋白偶联受体；人结节型基底细胞癌；迁移中图分类号 文献标识码 文章编号（）：，（，；，）（）（）（），第 卷 第 期 年 月 贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目国家自然科学基金（，）贵州医科大学 级硕士研究生通信作者：引用本文：许佳，韩宁，章俊，等 人结节型皮肤基底细胞癌病变组织和细胞株中视蛋白 的表达及功能 贵州医科大学学报，（）：，（），（）（）；，；，（），（）；，（.），（），（），；皮肤基底细胞癌（，）是 一 种 以 局 部 侵 袭 为 主 的 皮 肤 恶 性 肿瘤。可分为结节型（）、浅表型（）、硬化型（）、纤维上皮型（）、浸润型（）、色素型（），以及具有不同临床病理特征的其他亚型。的发病危险因素包括慢性日光暴露、年龄、免疫功能低下、电离辐射、使用光敏药物等，其中慢性日光暴露是最重要的环境因素，。黑素皮质素 受体（，）作为一种参与黑色素生成的膜 偶联蛋白，早被证明与 的发生具有显著相关性。视蛋白（，）是一种膜蛋白，属于 蛋白偶联受体（，）超家族。是 超家族中的一员，在人体肝脏、肺、心脏、肾脏及骨骼肌等多种组织中广泛分布。近年来有研究发现 在多种癌症中高表达，在某些癌症的发生、发展中起一定的调控作用。有研究表明，与可见光引起的色素沉着有关，其 的信号转导时可作为黑色素生成的负调节因子。然而，在基底细胞癌中的潜在作用目前尚不清楚。本研究探讨了 的表达水平在人结节型 病变组织及癌旁正常组织是否存在不同，它对人 系 细胞的增殖、迁移及侵袭是否具有调节作用，以及相关的调节机制。材料与方法.实验材料.细胞和组织 细胞系从 细胞库（货号 ）购买；选取本院 例结节型基底细胞癌患者的癌组织及距病灶 的癌旁正常组织（，）标本分别为病灶组与 组，储存于 冰箱，研究已获医院临床研究伦理委员会批准（）及患者知情同意。.主要试剂与仪器胎牛血清（，；美国 ），二脒基苯基吲哚（，）、抗荧光淬灭封片剂（上海碧云天），高糖培养基（，）、减血清培养基（，；美国），引物（上海生工），.结晶紫染色液、实时荧光定量 （期许佳等 人结节型皮肤基底细胞癌病变组织和细胞株中视蛋白 的表达及功能 ，）试剂盒、高效放射免疫沉淀法（，）组织 细胞裂解液（北京），（美国赛默飞），兔抗人 抗体、兔抗人 抗体、兔抗人 抗体、兔抗人 抗体、兔抗人 抗体、环磷腺苷效应元件结合蛋白（，）单克隆抗体、磷酸化（）单克隆抗体、钙调蛋白依赖激酶（，）单克隆抗体、磷酸化（）单克隆抗体、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗（中国 公司），（）检测试剂盒（日本），小室（美国），双染法细胞凋亡检测试剂盒（上海七海复泰）；多聚甲醛（国药集团化学试剂），流式细胞仪（美国 ），酶标仪和曝光仪 成像系统（美国），蛋白垂直电泳仪（美国），扩增仪（美国 ）。.实验方法.标本处理将 组与病灶组患者标本分别置于研钵，加液氮，反复多次用研磨器将其研磨呈粉状，收集于 管中。.组织免疫荧光 取“.”项下 组标本固定于 甲醛，石蜡包埋，石蜡切片脱蜡至水，置于 抗原修复液中微波修复抗原，血清封闭，加一抗（抗体），覆盖切片上的组织，过夜，加相应种属荧光二抗（山羊抗兔）于 孵育，加 染液室温避光染色，加抗荧光淬灭剂，盖玻片封片，荧 光 显 微 镜 下 观 察，蓝 色 为，绿 色为。.细胞培养 取人 细胞系 于含 和 双抗的 培养液，的 培养箱培养；隔天换液，培养细胞数量增殖到培养瓶底部面积的，含.胰蛋白酶的胰酶消化液消化细胞，待细胞从壁上脱离，终止消化。.实验采用 试剂提取“.”项下 组标本和“.”项下 细胞中的总，再逆转录为互补（，）。设置熔解曲线反应程序，采用熔解曲线分析引物特异性及与该反应体系的适宜条件，内参为甘油醛磷酸脱氢酶（，），根据课题组前期研究设计 引物序列，的表达水平按 值取对数值后进行分析；反应条件为 孵育 （变性），孵育 （退火）、孵育 （延伸）、退火与延伸重复 个循环。.蛋 白 印 迹 法（）实 验 取“.”项下 组标本和“.”项下 细胞置于冰上，组织细胞裂解液（，）：苯甲基磺酰氟（，）按 的配比比例配置适量 裂解液进行蛋白裂解，利用聚丙烯酰氨凝胶电泳（，）将目标蛋白分离，再转移至聚二偏氟乙烯（，）膜上，封闭液封闭 ，兔抗人的一抗工作液 孵育过夜，鼠抗兔的二抗工作液室温孵育 ；化学发光试剂（，）下进行拍照、曝光。采用 测量条带灰度值。.靶向沉默细胞中的 待“.”项下细胞生长至培养板板底面积 融合时备用。将细胞密度调至 个，分为对照（）组、空白（）组及实验（）组，于 孔板中分别加 及 培养基，采用 使小干扰 转染细胞，其中实验组小干扰 浓度为 ，继续培养，消化处理细胞。.实验取“.”项下细胞以 个 孔的密度均匀地接种于 孔培养板中，待细胞贴壁后，用 工作液转染细胞，分别在、及 加 试剂，放回细胞培养箱培养 ，处检测吸光度值；每组设置 个复孔，以保证实验精确性。.迁移实验取“.”项下细胞用无血清 培养基 重悬，使细胞浓度为 个，在 孔板内每孔加入 含 的 培养基，将 小室放入孔板内，消化处理细胞，无血清 培养基 重悬，使细胞浓度为 个，每个小室内加入 细胞悬液，培养 以上，取出小室，棉签擦拭上室细胞，多聚甲醛固定，.结晶紫染色，拍照。贵 州 医 科 大 学 学 报 卷.细胞划痕实验取“.”项下细胞以 孔的密度均匀地接种在 孔板上，加 培养基培养，待细胞长满整个孔板时，枪头垂直孔板划线，吸弃培养基，磷酸缓冲盐溶液（，）冲洗划下的细胞，放培养箱中培养；显微镜下拍照，分别检测于划痕后 、及 观察细胞的划痕宽度。每组设置 个复孔以上。.流式双染法细胞凋亡检测 用流式离心管收集“.”项下转染 细胞的上清液，利用.的胰酶消化细胞，收集消化好的细胞加入上清液离心，重悬细胞，再用 重悬细胞，再加入 并用移液器吹匀，在室温下避光孵育 ，加 染色液 混匀，冰浴避光放置 ，内用流式细胞仪检测。显示的是绿色荧光，代表凋亡的细胞。.统计学分析数据处理和分析使用 .软件。所有实验均重复 次以上；数据以均数 标准差（）表示，用 检验统计分析；.为差异有统计学意义。结果.组织中 的表达免疫荧光检测结果显示，在 组与病灶组中均有表达；和 结果显示，与 组比较，病灶组 患者病灶组织中 蛋白和 表达增高（.）。见图。注：为免疫荧光检测结果（），绿色为，蓝色为；、分别为 蛋白的检测结果和定量结果；为 表达量，（）与 组比较，.。图 病灶组和 组组织中 的表达 .细胞中 的表达采用 与 分别检测人 细胞系中 的蛋白与 水平，结果表明，与、及 比较，细胞系中 的蛋白和 水平最高（.）。见图。期许佳等 人结节型皮肤基底细胞癌病变组织和细胞株中视蛋白 的表达及功能注：、分别为 蛋白的检测结果和相对定量结果，为 相对表达量；（）与 比较，.；（）与 比较，.；（）与 比较，.；（）与 比较，.。图 人 细胞株 中 蛋白和 的表达 .下调 后细胞中 的表达小干 扰 沉 默 人 细 胞 系 中 的 后，和 实验结果显示，与 组、组 比 较，组 细胞中 的蛋白和 表达下降（.）。见图。注：、分别为 蛋白的表达和定量结果，为 表达量；（）与 组比较，.，（）与 组相比，.。图 下调 后各组人 细胞株 中 蛋白和 的表达 .细胞增殖活力 实验结果表明，与 组比较，下调 后 时 细胞 组增殖水平出现下降（.）。见图。.细胞迁移能力细胞划痕实验结果显示，与 组相比，下调 后 组 细胞迁移能力下降（.）；迁移实验结果显示，与 组相比，干预后 时 组 细胞迁移数量减少（.）。见图。.细胞的凋亡下调 后流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果显示，与 组比较，下调 后 组中凋亡细胞数量增加（.）。见图。注：（）与 组 比较，.。图 下调 后各组人 细胞株 细胞增殖水平的变化 贵 州 医 科 大 学 学 报 卷注：、分别为细胞划痕实验检测结果及定量结果，、分别为 迁移实验检测结果和定量结果；（）与 组比较，.。图 下调 后各组人 细胞株 的细胞迁移和划痕实验（结晶紫染色，）（，）注：、分别为流式细胞术的检测结果和定量结果；（）与 组比较，.。图 下调 后各组人 细胞株 的细胞凋亡 .钙依赖 信号通路相关蛋白的变化 通过 实验检测钙通路的相关蛋白、及 的表达，结果表明，下调 后，与 组相比，组人 细胞株 中 和 蛋白表达下降（.）。见图。期许佳等 人结节型皮肤基底细胞癌病变组织和细胞株中视蛋白 的表达及功能注：、分别为钙通路相关蛋白的检测结果和定量结果；（）与 组比较，.。图 下调 后各组 细胞株中钙通路相关蛋白的表达 讨论 包 括、及，是一类光感受器，属于 超家族，广泛参与细胞的增殖、分化、迁移。既往研究中 被证实在多种癌症中起到调控作用，等研究表明 在介导雌激素和他莫昔芬诱导的子宫内膜癌细胞的增殖和侵袭中起到了一定作用；张瑞华等研究认为 基因表达对皮肤鳞状细胞癌（，）蛋白激酶（，）信号通路及细胞侵袭能力具有一定的影响。作为 家族中的一员，在肝癌、肺癌及结肠癌等多种癌症中发挥重要作用。有研究认为，能通过调节细胞凋亡通路，从而使肝癌细胞对 氟尿嘧啶治疗敏感，主要机制是过表达 后使磷酸化蛋白激酶（，）和 细胞淋巴瘤 蛋白 相关 蛋白（，）比值抗凋亡途径失活；等研究显示，可以促进肺腺癌（，）中的上皮间充质转化（，）和肿瘤转移；已有研究提示，作为光受体，可能是临床上结肠癌的一个重要治疗靶点，它首先证实了 在结节型 病灶组的表达高于 组，为进一步探索 表达变化对 的影响，接下来利用小干扰 靶向沉默人 细胞中的，细胞增殖活性、迁移能力、凋亡细胞数量都发生了明显变化。这些结果均表明 可能在 的发生中起到了推动作用。关于 调控细胞的增殖、迁移及凋亡能力的机制，已有研究显示，的发生与遗传存在一定相关性，其中 基因多态性与基底细胞癌的风险之间存在一定遗传联系，且往往与皮肤颜色较深的人群相关性更大。基因编 码 的 蛋白是一种参与黑色素生成的 蛋白耦合受体，基因变异可见于非黑色素瘤皮肤癌（，）、日光性角化病及明显的弹力纤维增生症患者。此外，发生的高风险还与涉及刺鼠信号蛋白基因（，）和酪氨酸酶相关（，）基因的单核苷酸多态性有关，这些基因都与黑色素激素调节有关。既往研究显示，在调节 的信号转导时可作为黑色素生成的负调节因子。另外有研究表明，可在黑素细胞内储存中驱动钙动员并参与下游信号级联反应，且 是钙通道中的关键酶，的激活会导致 的磷酸化，在介导环磷酸腺苷（，）下游的 活化中发挥了一定贵 州 医 科 大 学 学 报 卷作用，并 且 是 的 主 要 下 游 靶标，。还有研究显示，紫外线诱导的活性氧（，）主要通过丝裂