人参发酵菌种的筛选及皂苷转化能力研究_朱珺.pdf

研究报告 年第 卷第 期（总第 期）：引用格式：朱珺，钱永清，吴琴，等 人参发酵菌种的筛选及皂苷转化能力研究 食品与发酵工业，（）：，（）：人参发酵菌种的筛选及皂苷转化能力研究朱珺，钱永清，吴琴，崔竞文，林国栋，李瑞，李理，陈苏（杭州娃哈哈科技有限公司，浙江 杭州，）（天津大学，浙江绍兴研究院，浙江 绍兴，）摘 要 以人参皂苷、转化情况为指标，从 株植物乳杆菌中筛选具有人参皂苷转化能力的菌株。考察优选菌株在人参提取液中的发酵特性以及多种皂苷转化情况，采用人结直肠肿瘤细胞模型考察菌株发酵液的抗肿瘤作用。结果显示，株菌株中植物乳杆菌 表现最优，转化率达到 ，提高倍数达。经 菌株发酵的人参提取液风味有所改善，在发酵 后，为 ，活菌数为 。与人参提取液相比，发酵液中皂苷、的含量显著降低（），种稀有皂苷（、）的含量则显著升高（）。菌株人参发酵液对肿瘤细胞的存活抑制率为（），显著高于未发酵前的人参提取液（）。结果表明，植物乳杆菌 具有良好的发酵特性，通过转化生成多种稀有人参皂苷，提高了人参产品的抗肿瘤活性，可用于发酵人参功能饮料的开发。关键词 植物乳杆菌；人参；发酵；稀有人参皂苷；抗肿瘤第一作者：博士，高级工程师（陈苏高级工程师为通信作者，：）基金项目：浙江省重点研发计划项目（）收稿日期：，改回日期：人参（）是五加科人参属植物的干燥根，在我国自古以来就是药食同源的植物，食用历史悠久。中医药学理论认为人参性平、味甘、微苦，具有滋补强壮、补脾益肺等功效。现代药理学研究表明，人参具有抗疲劳、提高免疫力、抗肿瘤等多种功效。人参皂苷、人参多糖、氨基酸和挥发性油类（萜类、醇类、脂肪酸类）是人参中的主要化学成分，其中人参皂苷是标志性活性成分。人参皂苷按其皂苷元结构可分为齐墩果烷型的五环三萜皂苷和达玛烷型的四环三萜皂苷，后者在人参皂苷中占大多数，依据苷元不同又可分为（）人参二醇系皂苷，如人参皂苷、等，以及（）人参三醇系皂苷，如人参皂苷、等。不同人参皂苷在人参中含量不同，、等普通皂苷含量较高，、等稀有人参皂苷则含量甚微。其中，普通人参皂苷很难被胃肠道直接吸收，生物利用率不高，在体内需要经过肠道菌群转化成稀有人参皂苷后才能够很好地发挥药理作用。冯亮等报道了大鼠灌胃人参皂苷后，血液中的代谢产物含量远高于原形药物的含量。等 的研究发现人参皂苷在胃中基本不发生变化，进入肠道后在肠道菌群作用下才逐步代谢成次级皂苷并发挥作用。植物乳杆菌（）是人类肠道菌群中的重要益生菌，对促进人体健康具有重要作用。同时，植物乳杆菌也广泛存在于各种发酵食品中，尤其在泡菜、发酵果蔬汁、发酵果酒等植物性发酵食品中应用广泛。植物乳杆菌基因组中含有大量编码碳水化合物代谢相关的酶系基因，包括多种与寡糖、聚糖水解相关的糖苷水解酶，如 葡萄糖苷酶等。已有研究报道微生物产生的酶作用在人参皂苷的、位上连接的糖苷，可水解掉部分或全部的糖苷，从而把含量较多的人参皂苷转换成活性更高的稀有人参皂苷，。因此，本研究从娃哈哈菌种保藏中心筛选具有优良人参皂苷生物转化能力的植物乳杆菌，通过植物乳杆菌发酵转化提升人参提取液中稀有皂苷的含量，提高人参产品的生物活性。经筛选所获得的植物乳杆菌 菌株可在较短的发酵时间内实现多种稀有人参皂苷的高效转化，符合大规模生产的高效性需求，为后续高附加值发酵人参功能饮料的产业化开发奠定了基础。材料与方法 材料与仪器 培养基，英国 生物试剂有限公司；低聚半乳糖液体，量子高科生物股份有限公司；人参粉，食品与发酵工业 （）靖宇县兴和特产品有限责任公司；株植物乳杆菌，娃哈哈菌种保藏中心；人参皂苷标准品（、），上海源叶生物科技有限公司；人结直肠癌细胞，中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；培养基、胎牛血清，美国 公司；细胞增殖检测试剂盒，南京建成生物工程有限公司；二甲基亚砜（，），美国 公司。生物安全柜，美国 公司；计，瑞士 公司；离心机，日本 株式会社；电热恒温培养箱、全波长酶标仪，德国 公司；高效液相色谱仪、超高效液相色谱仪，美国 公司；培养箱，德国 公司。实验方法 菌株培养于 条件下冷冻保存乳杆菌种子液，室温下解冻后，以 接种比例接种于 液体培养基中，于 下培养 ，连续活化 代。人参发酵实验称取适量人参粉（目），加入 倍常温水，沸水熬煮，经 目筛网过滤后，所得滤液经 离心 得到上清液。在上清液中添加低聚半乳糖液体，调整基料固形物含量（），取 试管分装，灭菌。获得人参提取液基料，冷却待用。取植物乳杆菌菌液转移至 无菌离心管，离心去除培养基后，加入相同体积的无菌水。旋涡振荡混匀后于 测定 值，调整菌液 值至 。将菌液以 的接种量接入准备好的人参提取液基料中，下静置发酵 。发酵结束后，立即 ，灭菌，终止发酵。除不接入菌液外其他操作一致。人参皂苷转化的分析菌株筛选实验的人参发酵液中的、含量采用高液相色谱仪（色谱系统）测定。色谱条件，色谱柱（，）；流动相乙腈（），水（），梯度洗脱（，；，；，；，；，）；流量 ；柱温；检测器；检测波长。将人参发酵液中的、含量与人参提取液基料中的、含量进行比较，计算转化率与 提高倍数。植物乳杆菌 菌株人参发酵液中的、含量采用超高液相色谱仪（）测定。色谱条件，色谱柱（，）；流动相乙腈（），水（），梯度洗脱（，；，；，；，；，；，）；流量 ；柱温 ；检测器，检测波长。发酵跟踪实验取植物乳杆菌 菌液，离心去除培养基后，加入相同体积的无菌水，振荡混匀后调整菌液 值至。将菌液以 的接种量接入人参提取液基料中，下静置发酵。发酵过程中，每隔 取样测定菌液的 值和，直至 。采用稀释涂布平板法测定活菌数并对发酵液风味进行评价。发酵液抗肿瘤能力测试人结直肠癌 细胞采用含 （体积分数）胎牛血清的 培养基在 、（体积分数）条件下以 比例连续传代 代后，取对数生长期细胞用于实验。调整细胞密度为 个 接种于 孔板中，每孔接入细胞悬液 。培养箱内生长 后，加入含药培养基 ，空白对照组每孔加培养基。将 孔板置于、条件下孵育 后，每孔加入 的噻唑蓝（，）试剂 。继续培养 后，弃上清液，加入 ，振荡溶解，采用酶标仪于 处测定 值。用公式（）计算肿瘤细胞抑制率：细胞抑制率 （用药组 值对照组 值）（）统计分析试验结果以平均值 标准偏差表示。显著性分析采用 软件，利用单因素方差分析（）中的 法进行比较检验，以 作为差异具有统计学意义的判断标准。结果与分析 植物乳杆菌转化人参皂苷能力的筛选是人参中含量较高的一种人参皂苷，则研究报告 年第 卷第 期（总第 期）是一种稀有人参皂苷，在野生人参中含量很少，在人工栽培的人参中甚至没有。采用高效液相法测定的人参发酵液中的皂苷含量，以 转化率、提高倍数为筛选指标对 株植物乳杆菌的皂苷转化能力进行评价，结果如表 所示。株植物乳杆菌均表现出一定的人参皂苷转化能力，但菌株的作用效果各不相同。各菌株的 转化率变化范围在 ，提高倍数从 倍到 倍。其中，综合两项指标，植物乳杆菌 表现出最强的人参皂苷转化能力，转化率达到 ，提高倍数达到 。因此，优选植物乳杆菌 菌株进行后续研究。表 株植物乳杆菌对人参皂苷、的转化作用 菌株转化率 提高倍数菌株转化率 提高倍数 植物乳杆菌 的发酵特性对优选的植物乳杆菌 菌株在人参提取液基料中的发酵情况进行跟踪，结果如图 所示。菌悬液 值的跟踪结果显示植物乳杆菌 在人参提取液中的发酵在 达到拐点，曲线也呈现类似趋势。在随后的第 ，菌悬液 值达到 ，人参料液的 由初始的 降低至 ，测定 菌株的活菌数，达到 。植物乳杆菌 发酵后对人参基料的色泽无明显影响，未观察到任何不良风味，基料原本具有的微苦的味道无明显变化，同时发酵使得人参料液原有的土腥味明显减弱。图 植物乳杆菌 在人参基料中的发酵曲线 植物乳杆菌 对人参皂苷的转化采用超高效液相色谱对植物乳杆菌 菌株发酵 后的人参发酵液中各皂苷的含量变化进行进一步的分析，结果如图 所示。图 所示为 种普通人参皂苷的含量变化情况，与人参提取液相比，发酵液中人参皂苷、的含量均发生显著降低（）。其中，下降比例最高，下降 ，其次为、。种稀有人参皂苷的含量变化情况如图 所示，人参提取液中人参皂苷、的含量经 菌株发酵显著升高（）。其中 在原人参基料中未有检出，经 发酵后提升至 。植物乳杆菌 人参发酵液的抗肿瘤作用为进一步评价 菌株人参发酵液的抗肿瘤作用，采用人结直肠肿瘤细胞 模型，通过 实验对细胞的增殖情况进行评价，结果如图 所示。人参发酵液对肿瘤细胞存在抑制作用，存活抑制率为（），显著高于未发酵前人参提取液的抑制率（），。结果表明，经植物乳杆菌 发酵后人参发酵液的抗肿瘤作用显著优于发酵前的人参提取液，可能与人参发酵液中稀有皂苷含量显著提高有关。食品与发酵工业 （）普通人参皂苷；稀有人参皂苷图 植物乳杆菌 发酵对人参提取液中 种人参皂苷含量变化的影响 注：表示 水平下差异极显著图 植物乳杆菌 的人参发酵液对人结直肠肿瘤细胞 的抑制作用 注：表示 水平下差异极显著 结论与讨论本研究对 株植物乳杆菌的人参皂苷转化能力进行评价，从中优选出植物乳杆菌。进一步的研究表明，菌株具有良好的发酵性能，经 菌株发酵获得的人参发酵液中稀有人参皂苷、的含量显著提升。其中，、都属于（）人参二醇系皂苷。赵林果等报道了一种制备 的方法，可以通过 葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶降解、来生产。弓晓杰参照人参皂苷肠道菌代谢机理，报道了酶 作用下的 转化途径：首先在 位的糖苷键断裂后失去一分子葡萄糖形成，在 位的末端失去一分子葡萄糖后会形成，随后再进一步脱去 位的上最后一分子葡萄糖，形成。在本研究中，经 菌株发酵后人参皂苷、均有下降，推测通过上述途径产生稀有皂苷、和。等以人参皂苷混合物为底物，研究了 种乳酸菌发酵过程对人参皂苷变化的影响，结果显示、的含量在发酵过程中持续下降。邵淇等报道了发酵乳杆菌和植物乳杆菌经过 的发酵可将人参皂苷 转化为 或。考虑到后续发酵人参饮料开发的可应用性，包括工业化生产的高效性和可连续性，本研究考察了发酵 后的人参皂苷的转化情况，也检测到了稀有皂苷、含量的显著提升。此外，菌株发酵还显著提升了、在发酵液中的含量。研究显示人参皂苷 在肿瘤的预防和治疗中起重要作用，可作为常规恶性肿瘤治疗的佐剂，具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移等多方面作用。人参皂苷 和 也具有类似抑制肿瘤细胞增殖或诱导肿瘤细胞凋亡的作用。因此，经 菌株发酵后的人参发酵液对人结直肠肿瘤细胞也表现出更强的抗肿瘤作用。人参作为传统中药 年被国家卫健委列入保健食品名单，年又被列为新资源食品，使得人参的食用形式不再拘泥于传统的人参粉、人参片，人参发酵酒、人参酸奶、人参发酵饮料等都可以成为新形式的人参食品。本研究挑选具有人参皂苷高效转化活性的植物乳杆菌 菌株，通过微生物发酵，在改善人参口感的同时，通过转化生成多种稀有人参皂苷，提高了人参产品的功能活性，也为后续高附加值的人参发酵功能饮料的开发奠定了基础。参考文献 闫清侠，刘莹莹，常百金，等 人参发酵产品研究进展 亚太传统医药，（）：，（）：浦凤玲，侯萍萍，张铁华 人参发酵工艺研究进展 食品研究与开发，（）：，（）：蔡小雨，闫培生，高秀君，等 人参皂苷生物转化的研究进展研究报告 年第 卷第 期（总第 期）中国农业科技导报，（）：，（）：裴文渊 人参乳酸菌发酵工艺优化及 对环氧丙醇所致细胞损伤的保护作用研究 长春：吉林大学，：，郑志忠，明艳林 人参皂苷体内代谢及其产物的生物活性海峡药学，（）：，（）：张怡轩，陈晓莹，赵文倩 人参皂苷生物转化的研究进展沈阳药科大学学报，（）：，（）：冯亮，胡昌江，余凌英 人参皂苷 及其代谢产物的药代动力学研究 药学学报，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）（，），（）：黄涛 我国传统泡菜中植物乳杆菌 的发酵特性及益生功能相关基因解析 南昌：南昌大学，：，（）：乔梦丹，刘尚，张琰，等 基于 研究人参皂苷在发酵过程中的生物转化 高等学校化学学报，（）：，（）：赵林果，赵东霞，解静聪，等 一种酶法制备稀有人参皂苷（）的方法：中国，（）：，弓晓杰 人参皂苷酶代谢产物化学修饰及其抗癌活