敲除G0S2基因对绵羊卵巢...醇激素及相关基因表达的影响_马钰静.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(6):325-334收稿日期：2022-11-14基金项目：国家绒毛用羊产业技术体系（CARS-39），国家肉羊产业技术体系（CARS-38）作者简介：马钰静，女，硕士研究生，研究方向：动物繁殖学；E-mail:通讯作者：刘月琴，女，教授，研究方向：羊繁殖调控；E-mail:L 敲除 G0S2 基因对绵羊卵巢颗粒细胞增殖、类固醇激素及相关基因表达的影响马钰静 段春辉 贺名扬 张英杰 杨若晨 王泳 刘月琴（河北农业大学动物科技学院，保定 071000）摘 要：本文旨在探究 G0S2 基因对绵羊卵巢颗粒细胞增殖，雌激素（E2）和孕酮（P4）分泌，以及类固醇分泌相关基因和细胞凋亡基因表达的影响。采集小尾寒羊新鲜卵巢，用割吸法收集中小卵泡的卵泡液，离心分离颗粒细胞，分为试验组和对照组，试验组采用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术敲除 G0S2 基因，获得重组表达载体 PX458-sgRNA-G0S2 转染至颗粒细胞；对照组转染PX458 质粒至颗粒细胞。检测颗粒细胞活力和凋亡情况，以及 E2和 P4水平及相关基因的表达量。结果表明，试验组 G0S2 mRNA的表达量及蛋白水平极显著低于对照组（P0.01），分别降低了 66%和 70%，G0S2 敲除成功。试验组颗粒细胞的增殖活力显著高于对照组（P0.05），细胞凋亡率极显著下降56%（P0.01）。试验组E2水平显著高于对照组（P0.05），P4水平显著低于对照组（P0.05）。试验组颗粒细胞中 StAR、CYP11、3-HSD 的表达量极显著低于对照组（P0.01），CYP19 的表达量极显著高于对照组（P0.01）。与对照组相比，试验组颗粒细胞中 Caspase3 和 Bax 的表达极显著下调（P0.01），Bcl-2 的表达极显著上调（P0.01）。上述结果表明，敲除 G0S2 基因能促进在绵羊卵巢颗粒细胞的增殖，抑制其凋亡，通过下调 StAR、CYP11、3-HSD，上调 CYP19 的表达影响 E2和P4的分泌。关键词：G0S2；绵羊；颗粒细胞；增殖；凋亡；类固醇激素DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1398Effects of Knockout of G0S2 Gene in Ovarian Granulosa Cell Proliferation,Steroids Hormones and Related Gene ExpressionMA Yu-jing DUAN Chun-hui HE Ming-yang ZHANG Ying-jie YANG Ruo-chen WANG Yong LIU Yue-qin（College of Animal Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000）Abstract:The objective of this research is to explore the effects of the G0S2 gene on the cell proliferation of ovarian granulosa cells,the secretion of estrogen（E2）and progesterone（P4）,as well as the expressions of steroid secretion-related genes and apoptosis genes.Fresh ovaries of small-tailed sheep were collected,and the follicular fluid gathered from small and medium-sized follicles by the suction method was centrifuged to separate the granulosa cells into experimental and control groups.The G0S2 gene in the experimental group was knocked out by CRISPR-Cas9 gene editing technology and the obtained recombinant expression vector PX458-sgRNA-G0S2 was transfected to the granulosa cells.The PX458 plasmid in the control group was transfected to the granulosa cells.The viability and apoptosis of the granulosa cells were detected,as well as the E2 and P4 concentrations and associated gene expression.The results showed that the relative abundance and the protein level of G0S2 mRNA in the experimental group were lower（P0.01）than those in the control group,reduced by 66%and 70%respectively,proving that the G0S2 was successfully knocked out.The proliferation activity of the granulosa cells in the experimental group was higher（P0.05）than the control group,and the apoptosis rate reduced（P0.01）by 56%.Compared with the control group,the E2 concentration was higher（P0.05）and the P4 concentration was lower（P0.05）in the experimental group.The expressions of genes StAR,CYP11 and 3-HSD in the 生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6326颗粒细胞作为卵泡发育的重要组成部分，在维持雌性动物生殖功能中起着重要作用1。研究表明，颗粒细胞的增殖分化可促进卵泡发育、卵母细胞成熟等，其凋亡是卵泡闭锁的主要原因，颗粒细胞的增殖和凋亡决定卵泡的发育和成熟2-3，对雌性动物繁殖性能的发挥至关重要。G0S2（G0/G1 switch gene 2）是编码一个含 103 个氨基酸的小分子蛋白，由 Russell 和 Forsdyke 在血液单核细胞中发现，可介导细胞从细胞周期的 G0 期过渡到 G1 期4。研究发现，G0S2 在与脂质代谢相关的组织中高度表达，如肝脏、脂肪、乳腺等，在卵巢组织中度表达，其作用涉及增殖、凋亡、炎症、代谢和癌变等，可以与脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）结合，抑制 ATGL 脂肪水解5，在癌症肿瘤细胞的增殖凋亡过程中起到了重要作用6。此前研究确定了 G0S2 的亚细胞定位、表达谱和调控机制7，阐明了 G0S2 在细胞增殖和分化中的可能作用5。在家禽上的研究表明，G0S2 通过调节脂肪组织的代谢稳态调控卵泡颗粒细胞发育，进而影响蛋鸡的产蛋量8，但在家畜上 G0S2 是否会影响卵巢颗粒细胞的增殖活力及凋亡还未见报道。基于此，本研究以绵羊卵巢颗粒细胞为模型，通过 CRISPR-Cas9 基因编辑技术敲除 G0S2 基因，研究 G0S2 对绵羊卵巢颗粒细胞增殖凋亡的调控作用及机制，以此为调控卵巢颗粒细胞发育提供新思路。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 材料 绵羊卵巢颗粒细胞为本实验室分离获取；质粒载体 pSpCas9（BB）-2A-GFP（PX458）购自 Addgene。1.1.2 试 剂 T4 DNA 连 接 酶、限 制 性 内 切 酶Bbs I-HF、rCutSmart-Buffer2.1、Stbl3 感 受 态 细 胞、PCR 产物纯化回收试剂盒购自博迈德公司；质粒小提试剂盒、Trizol、反转录试剂盒购自北京全式金公司；DMEM-F12 培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素混合液、DPBS 和胰蛋白酶购自 Gibco 公司；Lipofectamine2000、opti-Mem 购自赛默飞公司；一抗（G0S2 Rabbit pAb）、二抗（Goat-Anti-Rabbit IgG-HRP）购自 Abclonal 公司；酶联免疫分析测定试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司；1.1.3 仪 器 Real-time PCR 仪（Applied Biosystems公司），高速离心机（美国 Thermo Fisher 公司），HHS 型电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备），电脑三恒多用电泳仪（北京市六一仪器厂），全自动凝胶成像系统（BIO-RAD 公司），YXQ-SG46-280SA 型压力蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），倒置荧光显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司），恒温细胞培养箱 3111 型（美国赛默飞公司）。1.2 方法1.2.1 卵巢颗粒细胞的培养与鉴定1.2.1.1 绵羊卵巢颗粒细胞的采集与培养 在河北省保定市唐县瑞丽屠宰场采集小尾寒羊新鲜卵巢，放入盛有 37生理盐水（含 2%青霉素、2%链霉素）的保温瓶中，4 h 内带回实验室。将卵巢用酒精、生理盐水、DMEM-F12 依次清洗干净后，置于培养皿中，用无菌手术刀片割破卵泡，分离出颗粒细胞，用割吸法从卵巢中收集中小卵泡的卵泡液，与含 10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素和链霉素混合液和 89%DMEM-F12 的完全培养基混合，离心清洗，收集细胞沉淀，接种在培养瓶，置于 37、5%CO2培养箱中培养至贴壁。待颗粒细胞密度达到 70%-80%，将细胞传代至六孔板中，待六孔板中的细胞密度达到70%-80%时进行转染试验。experimental group was lower（P0.01）than the control group,and the expressions of CYP19 was significantly higher（P0.01）than the control group.Compared with the control group,the expression of Caspase3 and Bax in the experimental group of granulosa cells was significantly downregulated（P0.01）,and the expressions of Bcl-2 was significantly upregulated（P0.01）.Our results demonstrate that knockout of the G0S2 gene can promote the proliferation of ovarian granulosa cells,inhibit their apoptosis,and affect the secretion of E2 and P4 by downregulating the expression of genes StAR,CYP11,3-HSD and upregulati