纳米二氧化钛颗粒对人肝癌细胞HepG2中circRNA表达谱的影响.pdf

论著纳米二氧化钛颗粒对人肝癌细胞 中 表达谱的影响史佳琪马 莺张 奕陈章健贾 光(北京大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室北京)摘 要 目的:通过体外细胞实验探讨纳米二氧化钛颗粒()对人肝癌细胞()中环状核糖核酸()表达谱的影响并通过生物信息学分析 肝细胞毒性的潜在机制 方法:分别从粒径、形状、团聚状态等方面对 进行表征在暴露于、.、.、.、.、和 /或 后利用细胞计数试剂盒()检测 对 的细胞毒性 以 /(对照组)和 /(染毒组)的 处理 细胞 后收集细胞样本提取 并进行测序 筛选出对照组和 染毒组之间的差异通过多变量统计分析差异 靶基因的富集通路 根据测序结果筛选出显著改变的基因以及显著富集通路中的重要基因对 细胞进行实时逆转录聚合酶链反应()验证 结果:为球形锐钛矿在无血清培养基中的水合粒径为(.)电位为(.)细胞毒性检测结果发现随着 浓度的增加细胞活力逐渐下降 测序共发现 个 与对照组相比 染毒组(/)中共有 个差异其中 个上调 个下调 根据日本京都基因与基因组百科全书()富集分析差异 的靶向基因主要富集在脂肪酸降解、范可尼贫血()通路以及脂肪 酸 代 谢 等 通 路 上 验 证 结 果 显 示 代 表 性 差 异 (包 括.、.和.)的相对表达量在 染毒组和对照组之间差异有统计学意义与测序结果一致 结论:可诱导 表达谱发生改变提示表观遗传学可能在肝细胞毒性机制中发挥重要作用关键词 二氧化钛纳米颗粒肝细胞毒性环状 表观基因组学中图分类号 文献标志码 文章编号():./.()基金项目:国家自然科学基金()和科技部国家重点研发计划()()().网络出版时间:网络出版地址:/./.:()().:.()()././()/().()北京大学学报(医学版)().:(.)(.).(/).().:.二氧化钛()因其化学惰性、高折射率和低成本等特点被广泛应用于光催化、制药工业 和食品加工 等领域 纳米二氧化钛颗粒()的粒径为 与微粒级尺寸相比具有更大的可催化表面积因此纳米级颗粒会显示出更强的催化活性 具有抗菌性及高折射率等特点被普遍应用于食品加工等领域因此食品级(在欧盟被称为 在美国被称为)的安全性越来越受到关注 欧洲食品安全局认为 作为食品添加剂是不安全的 年初欧盟发布的委员会条例禁止将 作为食品添加剂但中国仍允许其作为食品添加剂使用因此对于 经口暴露的安全性还需进行研究肝脏是人体内药物代谢的最主要器官也是经口暴露于 后的主要靶器官 对于 肝毒性的研究很有必要故此本研究选择了一种常用于研究肝细胞毒性的细胞系即人肝癌细胞()除了细胞毒性和遗传毒性作用外 诱导的表观遗传变化也逐渐引起关注 表观遗传学是基因型和表型之间的重要纽带在许多细胞生命进程的调节中起着关键作用研究对象主要包括 甲基化、组蛋白修饰、非编码、顺式调控元件以及染色质高级结构 其中非编码 在许多细胞生命进程中起着重要作用它们的失调与各种疾病的发病机制有关 环状核糖核酸()是一类特殊的非编码 分子是共价闭环结构缺乏游离的 和 末端在物种间大量表达且高度保守 可以调节转录和翻译参与蛋白质的螯合反应和易位促进蛋白质之间的相互作用以及在蛋白质生物合成过程中起重要作用 为了充分评估 的毒性分析 的表观遗传作用至关重要 然而目前有关纳米材料对 影响的研究比较有限尚缺乏关于 在 诱导毒性过程中的功能方面的研究 因此本研究探讨了不同浓度 处理 细胞对 表达谱的影响并通过生物信息学分析 肝细胞毒性的潜在机制 材料与方法.实验材料 细胞来自中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院细胞资源中心 细胞培养液为 平衡盐溶液()、谷氨酰胺的 培养基 (体积分数)胎牛血清(质量分数)谷氨酰胺(/)(体积分数)非必需氨基酸溶液(无酚红)(质量分数)青霉素链霉素溶液 为球形锐钛矿纯度在.以上 详细的表征方法和结果参考本课题组前期发表的研究 利用动态光散射()测定无血清培养液中 的水合粒径 染毒液使用含、谷氨酰胺的 培养基溶解 至期望染毒浓度充分超声分散并涡旋混匀 染毒时选取对数生长期的细胞使用现配的相应浓度的 染毒液进行.细胞毒性检测使用 细 胞 计 数 试 剂 盒(购自)测定 的细胞毒性暴露于、.、.、.、.、和/和 后将 孔板中的细胞与 溶液共同孵育 收集上清液使用酶标仪检测以 为参比检测 处的光密度值 经过计算获得细胞活力结果根据国家标准/.细胞活力下降至 以史佳琪等 纳米二氧化钛颗粒对人肝癌细胞 中 表达谱的影响下表明具有潜在细胞毒性因此按照细胞活力大于的标准选取合适的染毒浓度和时间.测序经过相应的染毒时间后先使用 缓冲液清洗残余染毒液然后使用 法提取 凝胶电泳法对所提 进行质量检测合格后纯化 并去除核糖体()构建测序样本文库接着使用 测序仪进行测序经过碱基识别及误差过滤得到可以用于分析的原始测序片段.表达量分析运用 软件进行 预测与 数据库进行比对 区分已知的 和新的利用 脚本对预测的 进行分类统计 使用()对序列进行归一化处理后计算 表达量 应用 进行样本间差异 分析得出 值后采用错误发现率()校 正 进 行 多 重 假 设 检 验 同 时 根 据 值计算差异倍数()根据 值计算出所有样品之间的相关性然后通过主成分分析进行数据降维通过正交偏最小二乘法判别分析()实现对样本类别的预测 差异基因筛选条件须同时满足 .以及差异倍数 最后根据 的位置信息可以获得与 所在基因组位置上对应的编码基因对差异 的匹配基因进行()和日本京都基因与基因组百科全书()富集分析.验证使用实时逆转录聚合酶链反应()验证测序分析结果筛选显著改变的差异基因以及显著富集通路中的重要基因通过 网站(:/././)得到 细胞适用的内参基因 目的基因通过查询 网站(:/./)的“”设计相应的引物序列 目的基因和内参基因的引物序列见表 表 目的基因和内参基因的引物序列 ()().数据分析统计分析由.软件完成利用 .软件作图每个样本均设置三次重复平行样使用 正态性检验和 方差齐性检验连续变量数据均以均值 标准差表示所有检验均为双侧检验.呈现团聚状态.细胞毒性染毒 和 后随着 浓度的增加细胞活力逐渐下降(图)染毒 时/组的细胞活力(.)较对照组(/)显著下降但由于 /组的细胞活力过低我们最终选择了 /(细胞活力.)作为染毒组染毒时间为 .的定量和特征数据预处理后获得 个 主要分为外显子、基因区间和内含子三类分别有 、和 个其中染毒组和对照组占最大比例的均为外显子(图)主成分分析显示染毒组与对照组略分离(图)分析显示染毒组与对照组分离效果好表示 特征表达具有差北京大学学报(医学版)().异性(图)为防止过拟合采用置换检验进行验证()/染毒组与对照组相比.、说明获得的数据可靠模型对差异的识别能力强、预测能力好 ./.图 的细胞毒性 .差异表达量分析绘制相关性分析散点图发现染毒组与对照组的表达呈极弱正相关关系(图)差异表达的 火山图结果见图 按照 .、差异表达倍数 的筛选标准进行筛选最终发现与对照组相比染毒组共有 个差异 其中外显子占多数有 个 在所有差异表达的 中 个显著上调如.、.和.等 个显著下调如.、.和.等 染毒组与对照组之间差异 的热图如图 所示直观地表明了染毒组和对照组对 的影响不同.差异 富集通路分析基于差异表达 的靶基因进行 富集分析结果显示生物过程分类中基因富集程度排前三位的是细胞生命进程、代谢过程和单分子过程细胞成分分类中排前三位的是细胞组分、细胞和细胞器分子功能分类中排前三位的是结合、催化活性和核酸结合转录因子活性(图)基于差异表达 的靶基因进行 富集分析结果显示组织系统分类中基因富集程度排前三位的通路均与内分泌系统相关细胞生命进程分类中排前三位的通路为细胞集群、运输和分解代谢环境信息处理分类中排前三位的通路均与信号转导相关遗传信息处理分类中排前三位的通路与复制、修复以及折叠、分类和降解相关人体疾病分类中排前三位的通路均为癌症代谢分类中排前三位的通路为脂质代谢、氨基酸代谢和能量代谢 富集通路分析结果显示富集程度排前三位的通路为脂肪酸降解、范可尼贫血()通路以及脂肪酸代谢(图)富集在脂肪酸降解和脂肪酸代谢通路上的差异 均为.和.富集在范可尼贫血通路上的差异 为.和.验证根据 差异表达分析筛选出差异最显著的.和.从显著富集的脂肪酸降解及范可尼贫血通路中选择差异表达的.和.最 终 选 出 个 进行验证实验 如图 的 结果 显 示 /染 毒 后.、.和.的相对表达量与对照组相比均显著降低与测序结果一致 讨论本研 究 的 细 胞 毒 性 检 测 结 果 表 明 暴露会导致 细胞活力下降产生细胞毒性 很多研究已经证实肝毒性是 经口暴露的主要靶器官之一 也有研究发现肝脏是对 诱导的氧化应激最敏感的组织因此对于 诱导的肝毒性研究很有必要在纳米材料领域已经有很多研究利用 细胞系来检测潜在肝毒性具有一定的可靠性和可信度 等使用了 种不同浓度的 对 细胞进行染毒均发现了不同程度的细胞毒性与本研究结果一致以往研究显示表观遗传修饰是可遗传的并且可以通过保留表观遗传记忆在初始刺激暴露后持续存在而纳米材料会诱导 甲基化模式、组蛋白修饰或者 表达改变从而影响表观遗传变化这表明纳米材料可能对人类健康存在潜在的长期影响 本研究发现 可诱导肝细胞 表达谱改变并筛选出了 个差异 表明 可以引起肝细胞表观遗传学改变 表观遗传修饰是调控基因型和表型的重要环节它们的调控和失调往往导致疾病的发生和长期的负面影响 表观遗传学已开始逐步应用于纳米材料的毒性研究有研究发现低浓度的 可以改变负责表观遗传修饰的酶但该浓度远低于亚致死水平因此表观遗传学研究对于全面评估 暴露的潜在风险至关重要但目前尚缺乏 与 的关联研究 等用由甘草酸和锌离子组成的金属纳米载体处理原代肝细史佳琪等 纳米二氧化钛颗粒对人肝癌细胞 中 表达谱的影响胞发现过度表达的 可以通过抑制脂质代谢紊乱和炎症减轻非酒精性脂肪肝的进展 本 研 究 通 过 验 证 发 现 染毒会引起.显著下调其所在基因组位置上对应的编码基因为 可参与转录的调节及 模板化因此.显著下调可能影响 结合转录因子活性 ().()()./.图 染毒后的 表达量分析 ().().().图 染毒后的 差异表达分析 北京大学学报(医学版)().().().图 差异 的 和 富集分析 史佳琪等 纳米二氧化钛颗粒对人肝癌细胞 中 表达谱的影响 .图 染毒 后 个差异表达基因的 验证结果 本研究的通路富集分析发现 暴露可能干扰脂肪酸降解、范可尼贫血通路以及脂肪酸代谢等通路最终导致肝细胞毒性 一些体内研究也同样发现 暴露会诱导脂质代谢的变化 等将虹鳟鱼暴露于 后发现其肝细胞表现出轻微的脂肪变化和脂质化 但 等对 大鼠静脉注射./后并未发现其肝组织中的胆固醇和甘油三酯浓度产生变化需要进一步研究脂质代谢在 诱导的肝细胞毒性中的作用为解释和开展相关体 内 试 验 提 供 线 索 脂 肪 酸 降 解 通 路 上 的.(基因)显著下调该基因编码的蛋白可催化线粒体 氧化途径该途径是组织中的主要能量产生过程因此.显著下调可能阻碍线粒体产生能量范可尼贫血通路上的.(基因)显著下调范可尼贫血通路已被确定为一种 修复途径可清除阻碍 复制和转录的屏障 的表达与许多肿瘤中的 甲基化水平呈负相关并且与细胞凋亡、细胞周期及 损伤反应有关 本研究发现 暴露导致 表达水平显著下降这可能阻碍 修复进而造成遗传毒性总之本研究主要关注暴露于 后 细胞中 表达谱的改变及其在肝细胞毒性机制中的潜在作用结果表明暴露于 可 以 诱 导 以.、.和.为代表的一系列差异 变化提示表观遗传学可能在 诱导肝细胞毒性的机制中发挥重要作用参考文献 .:.:.:.():.().():.:.:.北京大学学报(医学版)()./.():.:.():.():.().().():.():.:.:.()():.():.():.():.():.():.周迪 陈章健 胡贵平 等.纳米二氧化钛亚急性经口暴露对大鼠氧化/抗氧化生物标志和炎性因子的影响.北京大学学报(医学版