ω-3多不饱和脂肪酸对急性肝功能衰竭小鼠肝细胞保护机制研究.pdf

第 39 卷第 6 期2023 年 6 月长春中医药大学学报Journal of Changchun University of Chinese MedicineVol.39 No.6Jun.2023637DOI:10.13463/ki.cczyy.2023.06.011-3 多不饱和脂肪酸对急性肝功能衰竭小鼠肝细胞保护机制研究张玉荣，李高峰，汤 彦，章美元*（复旦大学附属中山医院青浦分院急诊科，上海 201700）摘要：目的 探索-3 多不饱和脂肪酸（3-PUFA）对急性肝功能衰竭小鼠模型的肝细胞保护机制，为临床重症肝病的免疫营养治疗提供理论依据。方法 取100只小鼠，空白组8只未采取任何措施干预，其余92只采取D-氨基半乳糖（D-GaIN）联合脂多糖（LPS）诱导急性肝衰竭小鼠（BALB/C）造模，分成 4 组，未干预的模型组 20 只，用 3-PUFA 干预 24 只，以乌司他丁和促肝细胞生长素分别为阳性药物对照组，各 24 只，干预后 6、12、24 h 检测并比较各组小鼠相应血清炎症指标、肝功能的酶学、肝组织中 microRNA-122a 和肝脏组织病理学变化。结果 造模后，未干预前小鼠累计死亡 18 只，干预后 6、12、24 h 获得血清肿瘤坏死因子（TNF-）、白细胞介素 6（IL-6）、降钙素原（PCT）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、胆碱酯酶（CHE）、microRNA-122a 和相应病理学结果，3-PUFA 组、乌司他丁组和促肝细胞生长素组均表现为炎症指标的下降和 microRNA-122a 表达下降，均与模型组比较差异显著（P 0.05）。在组织病理学方面，模型组炎症程度随着时间推移逐步加重，大量浆细胞浸润和炎性渗出，3 组干预后，促肝细胞生长素组炎症减退和浆细胞浸润减少最明显，3-PUFA 组、乌司他丁组的结果相似。结论 3-PUFA 可能通过调节 microRNA-122a 表达对肝细胞起到抗炎、修复作用，具有免疫营养的潜在价值。关键词：小鼠；急性肝功能衰竭；-3 多不饱和脂肪酸；保护作用中图分类号：R575 文献标志码：A 文章编号：2095-6258(2023)06-0637-06Study on the protective mechanism of-3 polyunsaturated fatty acids on the hepatocytes in mice with acute liver failureZHANG Yurong,LI Gaofeng,TANG Yan,ZHANG Meiyuan*(Department of Emergency,Qingpu Branch of Zhongshan Hospital Affliated to Fudan University,Shanghai 201700,China)Abstract:Qbjective To explore the protective mechanism of-3 polyunsaturated fatty acids(3-PUFA)on the hepatocytes in mice with acute liver failure,and provide the theoretical basis for immunonutritional treatment of severe hepatopathy.Methods A total of 100 mice were selected,including 8 mice in the blank group without any intervention,and 92 mouse model(BALB/C)of the acute liver failure induced by D-galactosamine(D-GaIN)combined with lipopolysaccharide(LPS).The mice were divided into the model group without intervention(n=24),the 3-PUFA intervention group(n=24),the positive drug control groups ulinastatin group(n=24)and hepatocellular growth promoting hormone(HGHP)group(n=24).At 6h,12h,24h after the intervention,the corresponding serum inflammatory indicators,liver function enzymology,microRNA-122a in liver tissue and liver histopathological changes were monitored and compared in each group.Results After molding,18 mice died without intervention.Serum tumor necrosis factor(TNF-a),interleukin-6 (IL-6),calcitonin(PCT),alanine transaminase(ALT),aspartate transaminase(AST),cholinesterase(CHE),microRNA-122a and the liver histopathological results were obtained at 6h,12h,24h 基金项目：蚌埠医学院自然科学类项目（BYKY201926IZD）；2019 2022 年上海市医学重点专科建设项目（ZK2019B07）作者简介：张玉荣（1982），男，主治医师，主要从事急危重症、脓毒症诊治和 MODS 等研究*通信作者：章美元，电子信箱-第 39 卷第 6 期2023 年 6 月长春中医药大学学报Journal of Changchun University of Chinese MedicineVol.39 No.6Jun.2023638after the intervention.The 3-PUFA group,ulinastatin group and HGHP group showed a decline in inflammatory indicators and the microRNA-122a expression,which were significantly differences from the model group(P0.05).In terms of liver histopathology,the degree of inflammation in the model group gradually increased over time,with a large number of plasmic cell infiltration and inflammatory exudation.After the intervention of the three groups,the decrease of inflammation and plasma cell infiltration in HGHP group was the most obvious,and the results of the 3-PUFA group and the ulinastatin group were similar.Conclusion 3-PUFA may have anti-inflammatory and repair effects on the hepatocytes by regulating the expression of microrNA-122a,and has the potential value of immune nutrition.Keywords:mice;acute liver failure;-3 polyunsaturated fatty acids;protection 目前，脓毒症是一种致命性器官功能障碍综合征，感染是引发脓毒症的源头，是临床急危重患者常见病死原因之一。临床脓毒症患者往往存在高分解代谢和免疫紊乱，而机体免疫功能紊乱参与了脓毒症相关性肝损伤甚至急性肝衰竭的发生与发展过程，即使有效抗生素能够及时清除病原体，也需要免疫调节使促炎和抗炎恢复平衡，减少细胞因子风暴导致多器官功能障碍综合征（MODS）发生，故免疫调节治疗成为研究热点1。目前，-3 多不饱和脂肪酸在脓毒症中治疗效应已得到越来越多的关注，但治疗效果不一致，还存在许多不确定问题2-3。因此，有必要进一步研究-3 多不饱和脂肪酸对脓毒症相关性的急性肝衰竭是否存在抗炎、修复等保护作用。1 材料与方法1.1 实验动物与分组 选取 BLAB/C 小鼠 100 只，雌雄各半，均 6 8周龄，体质量（212.6）g，由扬州大学比较医学中心提供 许可证号：SCXK（苏）2021-0009。遵循有关实验动物管理和使用的规定，本研究经复旦大学附属中山医院青浦分院批准（EC-C-015-A01-V03）。空白组 8 只，造模后随机分成 4 组：模型组 20 只，乌司他丁组 24 只，3-PUFA 组 24 只，促肝细胞生长素组 24 只。各组在造模和干预治疗后6、12、24 h 时间点留取标本。动物 6 只，笼饲养，自由饮水和饮食。1.2 动物模型制备和干预治疗措施 小鼠自由饲养 1 周，禁食 1 天，自由饮水，先予以 D-氨基半乳糖 800 mgkg-1（南京市生物有限公司）加脂多糖（8 mgkg-1，批号：I4319，sigma）腹腔注射造模，随后 2 h 予以乌司他丁（0.5万kg-1，国药准字：H19990134）腹腔注射，3-PUFA（0.2 gkg-1，国药准字：J20100092）加无菌注射10%糖水稀释后尾部静脉注射，促肝细胞生长素（20 mgkg-1，国药准字：H20046249）腹腔注射。1.3 血清标本采集和相关检测 按照干预后时间点 6、12、24 h 采集标本，留取静脉血，3 000 rmin-1，离心 10 min 后，分离出血清放置-70冰箱存放，统一检测。采取 ELISA检测血清降钙素原（PCT）、肿瘤坏死因子（TNF-）、白介素 6（IL-6）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和胆碱酯酶（CHE），严格按照说明书操作。1.4 肝组织标本采集 采集血清标本后，留取肝组织（生理盐水冲洗后），肝组织放置预先留有 2%甲醛溶液的标本瓶，用于做病理 HE 染色观察，另为无菌干燥瓶，分别放入组织标本，统一称质量 1 g，然后加入 0.9%生理盐水 2 mL，制作组织均浆，4 000 rmin-1离心10 min 后，留取上清液 1 mL，在 miRBase 上查寻目的基因序列，由美国 Invitrogen 公司设计合成引物，提取上清液中 miRNAs，合成 cDNA。以 U6 作为内参，在 9700 型基因扩增仪中扩增 miRNAs。RT-PCR 反应条件：95预变性 10 min，95变性 10s，60退火 60 s，共 37 个循环。采用 2-CT（Livak）法计算肝组织 microRNA-122a 的相对表达量。1.5 统计学方法 采 用 SPSS 20.0 软 件 进 行 数 据 分 析 处 理，TNF-、IL-6、PCT、ALT、AST、CHE、microRNA-122a 水平等计量资料以均数 标准差（sx）表示，组间、组内结果比较采用t检验，以P 0.05 表示差异有统计学意义。2 结果2.1 各组小鼠变化比较 空白组小鼠表现正常饮食