P2X7受体_NLRP3轴对痛风急性发作的调控作用机制研究.pdf

第 39 卷第 6 期2023 年 6 月长春中医药大学学报Journal of Changchun University of Chinese MedicineVol.39 No.6Jun.2023632DOI:10.13463/ki.cczyy.2023.06.010P2X7 受体/NLRP3 轴对痛风急性发作的调控作用机制研究刘业洲，李 瑞，白 冰，崔月娜，贺 怡，陈邬锦，孙玉萍*（新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐 830000）摘要：目的 探究 P2X7 受体/NLRP3 轴在痛风急性发作小鼠模型中的调控作用机制。方法 将 C57 小鼠随机分为 5组：对照组（注射生理盐水，8 只）、模型组（构建痛风小鼠模型，8 只）、C 组为 NLRP3 抑制剂组（模型动物鞘内注射 NLRP3 抑制剂，8 只）、D 组为 P2X7 抑制剂组（模型动物鞘内注射 P2X7 抑制剂，8 只）、E 组为 P2X7 抑制剂+NLRP3 激活剂组（模型动物鞘内注射 P2X7 抑制剂+NLRP3 激活剂组，8 只）。造模结束称质量后处死小鼠，取各组小鼠的静脉血和肝肾组织。使用 ELISA 试剂盒检测促炎因子 IL-1、IL-6、TNF-表达情况；Western blot 检测小鼠肠组织中 NLRP3、IL-1、ASC、Caspase-1、P2X7 相关蛋白的表达情况。结果 与对照组比较，模型组小鼠 IL-1、IL-6、TNF-表达提高（P 0.05），NLRP3、ASC、Caspase-1、P2X7 蛋白表达水平增加（P 0.05）；与模型组比较，抑制 NLRP3 表达，IL-1、IL-6、TNF-表达降低（P 0.05）；与模型组比较，抑制 P2X7 表达，IL-1、IL-6、TNF-、P2X7 与 NLRP3 的表达降低（P 0.05）；与模型组比较，抑制 P2X7 表达，同时过表达 NLRP3，IL-1、IL-6、TNF-表达无统计学意义（P 0.05）；NLRP3、ASC、Caspase-1 降低，P2X7 表达增加（P 0.05）。结论 P2X7 受体/NLRP3 轴能够促进痛风急性发作小鼠模型的炎症作用，可作为药物研发的重要靶点，对疾病的治疗具有参考意义。关键词：急性痛风性关节炎；炎性反应；NLRP3/P2X7 受体轴；小鼠模型中图分类号：R574.62 文献标志码：A 文章编号：2095-6258(2023)06-0632-05Study on the regulation mechanism of P2X7 receptor/NLRP3 axis on acute attack of goutLIU Yezhou,LI Rui,BAI Bing,CUI Yuena,HE Yi,CHEN Wujin,SUN Yuping*(School of Basic Medicine,Xinjiang Medical University,Urumqi 830000,China)Abstract:Objective To explore the regulatory mechanism of P2X7 receptor/NLRP3 axis in the mouse models of acute attack of gout.Methods C57 mice were randomly divided into the control group(injection of normal saline,8 mice),the model group(construction of gout mouse model,8 mice),group C(NLRP3 inhibitor group,8 mice,intrathecal injection of NLRP3 inhibitor in model animals),group D(P2X7 inhibitor group,8 mice,intrathecal injection of P2X7 inhibitor in model animals),and group E(P2X7 inhibitor+NLRP3 activator group,8 mice,intrathecal injection of P2X7 inhibitor+NLRP3 activator in model animals).At the end of modeling,the mice were killed after weighing,and the venous blood,liver and kidney tissues of the mice in each group were taken.The expressions of proinflammatory factor interleukin 1(IL-1),IL-6 and tumor necrosis factor-(TNF-)were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)kit.The expressions of NLRP3,IL-1,ASC,Caspase-1 and P2X7 related proteins in mouse intestinal tissues were detected by Western blot.Results Compared with the control group,the expression levels of IL-1,IL-6,TNF-,NLRP3,ASC,Caspase-1,and P2X7 proteins were increased in the mode group,and there were significant differences(P0.05).Compared with the the model group,the expression of NLRP3 was inhibited,the expressions of 基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金（2021D01C275）作者简介：刘业洲（1994），男，硕士研究生，主要从事肠道菌群及代谢性疾病相关研究*通信作者：孙玉萍，女，教授，博士研究生导师，电子信箱-第 39 卷第 6 期2023 年 6 月长春中医药大学学报Journal of Changchun University of Chinese MedicineVol.39 No.6Jun.2023633 急性痛风性关节炎（Acute Gouty Arthritis，AGA）是因为尿酸钠晶体沉淀引起的一种慢性炎性风湿病1-2，近年来发病率逐年增高，并呈现出年轻化趋势3-4。该病病因可能是由于细胞外液尿酸钠或其结晶沉淀在关节滑膜组织，引起炎症反应。痛风病人的慢性炎症会持续很长时间，在急性期会加重，导致组织肿胀，但白细胞、CRP 等感染性指标不会有太大的改变，一般都是通过炎性因素来衡量炎症的严重程度5。P2X7 受体是一种双向功能受体，在受体的第2 跨膜区上，形成一个离子通路6；离子的运动与薄膜的电压有关，参与了炎症反应的发生与发展。因此，在诸多炎症性疾病均可检测到其异常的表达情况能够促进炎性介质如 IL-1、IL-6、IL-18、TNF-等释放。研究7表明，P2X7 可能激活其下游炎症相关的通路，通过激活NLRP3复合体，招募ASC和Caspase-1前体，使其成为有活性的 Caspase-1（IL-1 转化酶），持续的 ATP 刺激又可使 P2X7 受体阳离子通道转变成非选择性质膜孔，便于 IL-1 释放至细胞外发挥炎性作用8。本研究基于 NLRP3/P2X7 受体轴探讨 NLRP3与 P2X7 受体在痛风中的调节作用机制，以期为后续的药物研究探寻重要的靶点。1 材料与方法1.1 材料 C57 小鼠 40 只，9 周龄，体质量 2330 g，雄性，由新疆医科大学提供，实验动物生产许可证号：SCXK（新）2018-0001，伦理批号：S20130418-3。试验前将小鼠置于（232）屏障级动物房中饲养1 周，标准饲料，饮用水为自来水。1.2 药物与试剂 尿酸钠盐，由 Sigma（美国）公司制造，戊巴比妥钠，购于北京源博汇科生物技术研究所。吐温-80，Sigma（美国）公司，IL-1、IL-6、TNF-ELISA 试剂盒，购于北京欣博盛生物技术有限公司，批号：20191108；NC 薄膜，0.45 m 孔径，德国 Sartorius 制造；牛血清白蛋白（BSA），购自赛默飞（美国）公司，批号：930342；NLRP3 表达抑制剂 Dapansutrile，CAS 号：54863-37-5，购自上海麦克林生化科技有限公司；P2X7 表达抑制剂 A-740003，NLRP3 激活剂，货号：BMS-986299（compound 112），以上购自 MedChemexpress 安诺伦（北京）生物科技有限公司。一抗：NLRP3，货号 MA5-32255，稀释度 1:500，ASC，货号 PA5-50915，稀释度 1:500，Caspase-1，货号 14-9832-82，稀释度 1:500，P2X7，货号 PA5-28020，稀释度 1:500，以上均购自赛默飞（美国）公司，IL-1，货号 ab254360，稀释度 1:500，购自Abcam（美国）公司。1.3 实验仪器 3-18K 型，冷冻型高速离心机，德国 Sigma 公司生产；全自动酶标分析仪，安图实验仪器（郑州）有限公司；GLP-F300 型，全自动生化分析仪，迪瑞医疗科技股份有限公司，CS-1200 型；电泳槽，孚约生物科技（上海）有限公司，通用型；电泳仪，赛默飞生物有限公司。1.4 模型制作及分组 将单钠尿酸盐加入 0.9%的氯化钠注射液，再加入Twin-80（9:1），加1 mL 1.5 moLL-1 NaOH，加热，搅拌，配制为25 mg mL-1的尿酸钠混合液，4下贮存，使用前摇匀。采用随机数表法，将C57小鼠分成5组，分别为对照组（0.9%的氯化钠注射液，8 只）、模型组（8 只）、C 组（小鼠模型鞘内注射 P2X7 抑制剂，8只）、D组（小鼠模型鞘内注射NLRP3抑制剂，8只）、E 组（小鼠模型鞘内注射 P2X7 抑制剂+NLRP3 激活剂，8只）。模型制作参照文献7方法造模。使用0.9%氯化钠注射液（溶解单钠尿酸盐）C57 小鼠足部左后外侧踝部注射；以 0.9%的氯化钠注射剂作为对照组，每天 1 次，连续 7 d。造模组关节比健侧组皮肤温度IL-1,IL-6 and TNF-were reduced in group C(P0.05).Compared with the model group,the expression of P2X7 was inhibited,the expressions of IL-1,IL-6,TNF-,P2X7,and NLRP3 in group D were decreased(P0.05);The expressions of NLRP3,ASC and Caspase-1 were decreased and and the expression of P2X7 was increased in group E(P0.05).Conclusion P2X7 receptor/NLRP3 axis can promote inflammatory effect of acute attack of gout in mouse models,and can be used as an important target for drug development,and has reference significance for the treatment of th