TRIM33通过SIRT1...在肺癌中的功能及其机制研究_张贝.pdf

分类号：密级：U D C：学号：401442720032 南 昌 大 学 硕 士 研 究 生 学 位 论 文 TRIM33 通过通过 SIRT1 依赖的去乙酰化修饰调控依赖的去乙酰化修饰调控MCM7 在肺癌中的功能及其机制研究在肺癌中的功能及其机制研究 Role and mechanism of TRIM33 in regulating MCM7 function through SIRT1-dependent deacetylation in lung cancer 张贝 培养单位（院、系）：南昌大学基础医学院 指导教师姓名、职称：谢彩凤 副教授 申请学位的学科门类：医学 学科专业名称：基础医学 论文答辩日期：2023 年 6 月 3 日 答辩委员会主席：郑里翔 评阅人：盲审 盲审 2023 年 6 月 摘要 II 摘摘 要要 研究背景：研究背景：肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是全球死亡率最高的癌症，而其中非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要类型。虽然在过去的几十年肺癌的临床治疗取得了很大的进展，但目前肺癌的 5 年总生存率（OS）仅 18%19%，而 NSCLC 的OS 约为 15%。肺癌患者的 OS 相对较低可能归因于缺乏高度敏感的早期筛查诊断和精确的靶向治疗。因此，寻找新的分子靶点，对于提高肺癌患者生存率、改善预后具有重要的意义。TRIM33（Tripartite Motif Containing 33）是三结构域蛋白（TRIM）家族中的一员，由于该家族成员普遍具有 RING 结构域，被视为一类典型的 E3 泛素连接酶，广泛参与了免疫、炎症、肿瘤等生理病理过程。其中，TRIM33 在肿瘤中的功能较为复杂，其在不同肿瘤中可能发挥的作用不同。目前对于 TRIM33 在肺癌中的功能及其机制并不明确，特别是 TRIM33 是否通过其 E3 泛素连接酶的功能影响 NSCLC 的发生发展亦不可知。目的：目的：通过细胞表型实验分析 TRIM33 在非小细胞肺癌中的功能，后发现 TRIM33可抑制 NSCLC 细胞增殖，但其具体作用机制不明确。本文将探讨 TRIM33 通过微小染色体维持蛋白 7（Minichromosome maintenance protein 7，MCM7）调控细胞增殖的潜在机制，并将进一步分析该调控机制与 TRIM33 的乙酰化修饰之间的可能联系。方法：方法：（1）通过蛋白免疫印迹实验(Western Blot)检测 TRIM33 在正常肺上皮细胞和NSCLC 细胞株中的表达情况。利用 TCGA 和 GTEx 数据库分析 TRIM33 在正常肺组织和 NSCLC 组织中的差异表达情况，以及 TRIM33 与疾病分期和患者生存期的关联。（2）构建 TRIM33 过表达和敲除质粒，用细胞生长实验和 transwell 实验评估NSCLC细胞株 NCI-H1299 在TRIM33 过表达或敲除条件下的细胞增殖和迁移情摘要 III 况。用 Western Blot 检测 N-cadherin、-catenin、Vimentin 和 Snail 的蛋白水平考察细胞的 EMT 情况。（3）利用质谱分析法(MS)、免疫共沉淀(Co-IP)和免疫荧光技术(IF)确定TRIM33 和 MCM7 的相互作用，用 Western Blot 检测过表达或者沉默 TRIM33 对MCM7 蛋白水平的影响。接着通过 Co-IP 检测过表达 TRIM33 后 MCM7 的泛素化水平变化。（4）用广谱去乙酰化酶抑制剂 TSA 和 NAM 处理细胞，检测 TRIM33 的乙酰化、mRNA 和蛋白表达水平变化。（5）检测外源表达去乙酰化酶 SIRT1、SIRT6 和 SIRT7 后 TRIM33 的蛋白水平变化。再通过 Co-IP 验证 SIRT1 和 SIRT6 与 TRIM33 的蛋白相互作用，及二者对 TRIM33 乙酰化水平的影响，以确定 TRIM33 的特异性去乙酰化酶。最后用Co-IP 检测 SIRT1 是否参与 TRIM33 调节 MCM7 泛素化的过程。结果：结果：（1）与正常的肺上皮细胞相比，NSCLC 细胞系中 TRIM33 的表达显著下调。数据库分析结果显示，与邻近的癌旁组织相比，TRIM33 在 NSCLC 组织中的表达下调，且 TRIM33 低表达的 NSCLC 患者生存率较差。此外，TRIM33 与疾病分期无显著相关性。（2）过表达 TRIM33 抑制了 NSCLC 细胞的生长、迁移和 EMT 相关蛋白表达，而敲除 TRIM33 则促进了细胞的生长、迁移和 EMT 相关蛋白表达。（3）质谱与免疫荧光染色显示 TRIM33 可能与 MCM7 存在蛋白互作及细胞共定位，免疫共沉淀进一步证明TRIM33与MCM7相互作用并增加其泛素化水平，但是 TRIM33 不影响 MCM7 的蛋白稳定性。（4）去乙酰化酶 SIRT 广谱抑制剂 NAM 处理可上调 TRIM33 的乙酰化水平，但不影响其 mRNA 和蛋白表达水平；而另一乙酰化酶 HDAC 广谱抑制剂 TSA则对 TRIM33 的蛋白表达和乙酰化水平均无显著影响。（5）具有细胞核定位的去乙酰化酶 SIRT1 和 SIRT6 均与 TRIM33 存在蛋白互作，但仅有 SIRT1 可直接促进 TRIM33 的去乙酰化，同时 SIRT1 的存在影响TRIM33 对 MCM7 的泛素化修饰。结论：结论：我们的研究揭示了 TRIM33 抑制 NSCLC 细胞增殖及迁移的可能分子机制。摘要 IV 特别是提示了 TRIM33 可通过 SIRT1 依赖的去乙酰化调控其对 MCM7 的泛素化修饰，进而影响细胞增殖，参与肿瘤的发生发展。关键词：关键词：非小细胞肺癌；三结构域家族 33；微小染色体维持蛋白 7；去乙酰化酶SIRT1；泛素化 Abstract V ABSTRACT Background:Lung cancer is one of the most common malignant tumors and cancer with the highest mortality rate in the world,and non-small cell lung cancer(NSCLC)is the main type of lung cancer.Although the clinical treatment of lung cancer has made great progress in the past few decades,the current 5-year overall survival(OS)rate of lung cancer is only 18%-19%,and the OS of NSCLC is about 15%.The relatively low OS of lung cancer patients may be attributed to the lack of highly sensitive early screening diagnosis and precisely targeted therapy.Therefore,finding new molecular targets is of great significance for improving the survival rate and prognosis of lung cancer patients.TRIM33(Tripartite Motif Containing 33)is a member of the Tripartite Motif Containing 33(TRIM)family.Since members of this family generally have a RING domain,it is regarded as a typical type of E3 ubiquitin ligase,and is widely involved in immunity,inflammation,tumors and other physiological and pathological processes.Among them,the function of TRIM33 in tumors is relatively complex,and it may play different roles in different tumors.In addition,the function and mechanism of TRIM33 in lung cancer are not clear at present,especially whether TRIM33 affects the occurrence and development of NSCLC through the function of its E3 ubiquitin ligase.Objective：The function of TRIM33 in non-small cell lung cancer was analyzed by cell phenotype experiments,and it was found that TRIM33 can inhibit the proliferation of NSCLC cells,but its specific mechanism remains unclear.This article will explore the potential mechanism by which TRIM33 regulates cell proliferation through minichromosome maintenance protein 7(MCM7),and further analyze the possible connection between this regulatory mechanism and the acetylation modification of TRIM33.Methods：Abstract VI(1)The expression of TRIM33 in normal lung epithelial cells and NSCLC cell lines was detected by Western Blot.The TCGA and GTEx databases were used to analyze the differential expression of TRIM33 in normal lung tissue and lung adenocarcinoma tissue,and the association of TRIM33 with disease stage and patient survival.(2)Construct TRIM33 overexpression and knockout plasmids,and evaluate cell proliferation and migration of NSCLC cell line NCI-H1299 under TRIM33 overexpression or knockout conditions by cell growth experiments and transwell experiments.The protein levels of N-cadherin,-catenin,Vimentin,and Snail were detected by Western Blot to examine the EMT.(3)The interaction between TRIM33 and MCM7