快速微生物检测技术在放射性药品中的应用展望.pdf

快速微生物检测技术在放射性药品中的应用展望邵长芳,孔浩,孙祥敏,杜建冬,张云(原子高科股份有限公司,北京 )D O I:/b j m y i s s n 收稿日期:;修回日期:通讯作者:张云.摘要:放射性药品多为效期短、非终端灭菌的注射剂,该类药品的微生物检测周期宜控制在较短的时间内,传统微生物检测方法在应对具有快速检测需求的放射性药品时往往力有不逮.近年来出现的快速微生物检测技术具有检测效率高、自动化程度强、即时监控等特点,不但可以填补传统检测方法的不足,而且在药品微生物检验数据的可靠性评价、药品生产过程控制方式改进等方面具有重要的参考价值.本文阐述了快速微生物检测技术的原理和近年相关机构和各国药典中所报道的研究进展,并对该技术应用于放射性药品检测的前景进行了展望.关键词:快速微生物检测技术;研究进展;放射性药品;过程控制中图分类号:R ;R 文献标识码:AT h eP r o s p e c t o fR a p i dM i c r o b i o l o g i c a lM e t h o d s i nR a d i o p h a r m a c e u t i c a l sS HAOC h a ngf a ng,KONG H a o,S UNX i a ngm i n,DUJ i a n d o ng,ZHANGY u n(H T AC o,L t d,B e iji ng ,C h i n a)A b s t r a c t:R a d i oph a r m a c e u t i c a l sa r ec o mm o n lyn o n t e r m i n a ls t e r i l i z a t i o ni nje c t i o nw i t hs h o r tpe r i o do fv a l i d i tyt h a tr equ i r es h o r td e t e c t i o nd u r a t i o n,m a k i ngt r a d i t i o n a l m e t h o d su n c o mpe t i t i v ef o rr a d i oph a r m a c e u t i c a l s T h er api d m i c r o b i o l ogi c a lm e t h o d s(RMM)d e v e l ope di nr e c e n tye a r sa r eh igh lye f f i c i e n ta s a u t o m a t e d,a n d r e a l t i m e m o n i t o r i ngt e c h n o l ogi e s,w h i c h c o u l d n o t o n lyc o mpe n s a t et r a d i t i o n a ld e t e c t i o nm e t h o d sb u ta l s opr o v i d es ign i f i c a n t i n s igh t sf o rt h ee v a l u a t i o no ft h ed a t ar e l i a b i l i tyo f t h em i c r o b i o l ogi c a ld e t e c t i o na n dt h ec o n t r o lo ft h em a n u f a c t u r i ngpr o c e s so ft h eph a r m a c e u t i c a l s I nt h i sr e v i e w,w es u mm a r i z e dt h epr i n c ipl ea n dr e c e n tpr ogr e s so fr api dm i c r o b i o l ogi c a lm e t h o d sr epo r t e d byr e l e v a n to rga n i z a t i o n sa n dt h eph a r m a c ope i a so fd i f f e r e n tc o u n t r i e s,a sw e l l a s t h epr o spe c to f t h i s t e c h n o l og yi nr a d i oph a r m a c e u t i c a l s K e yw o r d s:R api dm i c r o b i o l ogi c a lm e t h o d s(RMM);R e s e a r c hpr ogr e s s;R a d i oph a r m a c e u t i c a l s;C o n t r o l o f t h em a n u f a c t u r i ngpr o c e s s微生物检测是药品质量控制的重要一环,微生物检测包括无菌检查、微生物限度、微生物鉴定等.目前在制药企业中占据主导地位的传统无菌检查方法具有操作简单、结果可靠、成本低等优点,适合大多数微生物检测实验室.但是由于传统检测方法多为检验周期长,检测结果往往滞后于生产过程,导致该方法难以实时反馈生产过程中微生物污染情况和产品质量等问题.检测周期长导致药品、原料、辅料等的放行周期也长.因此,发展能够快速对微生物进行无菌检查的方法就显得尤为重要.快速无菌检查方法的发展及应用现状自 世纪初以来,微生物检测技术得到了快速的发展,其中快速微生物检测方法(r a p i dm i c r o b i o l o g i c a lm e t h o d s,R MM)现已被大多数临床微生物和食品检验实验室接纳,并且在制药行业中也逐渐得到了应用.相比于传统的无菌检查方法,RMM不仅具有实时或近实时的监控能力,而且检测过程快速、操作简便,在生产过程指导、缩短产品放行时间和产品出厂周期等方面均具有较高的潜力.当前应用较为广泛的RMM主要包括检测微生物培养过程中产生的特定信号的技术(三磷酸腺苷生物发光技术、等温微量量热技术、气体测定技术)、细胞检测技术(流式细胞技术、固相细胞技术)、基因识别技术(核酸扩增技术)等.这些技术均可实现对L a b e l e dI mm u n o a s s a y s&C l i nM e d,M a r ,V o l ,N o 中间产品和终产品的无菌检查,不但可以缩短检验周期、大幅提高检测效率和自动化程度,而且可为微生物检验数据的可靠性验证提供新思路,目前主流应用的RMM主要包括以下大类.三磷酸腺苷生物发光技术 年,M cE I R OY和S T R EHL E R阐述了三磷酸腺苷(AT P)生物发光技术的机理,这项工作证实了荧光发光强度与体系内的AT P含量成正比.该项技术的基本原理为:AT P首先与荧光素在荧光素酶的催化下生成荧光素 AMP复合体,并进一步被氧化成激发态氧化荧光素,最终氧化荧光素回归基态,并发出光子,通过检测光子数量即可计算出样品中AT P的含量,进而反映样品中所含微生物的量.该技术对微生物数量等级的检出限比传统目视浊度检测方法低个数量级,对液体培养基中微生物的检出限可达 c f u/m L.如果使用液体培养基预培养 d的方式富集微生物,再进行检测,可以达到更高的灵敏度.魏树源等研究了AT P生物发光技术应用于疫苗中间品无菌检查的可行性,在接种样品后进行 h的预培养,检测结果与中国药典无菌检查法中的检测结果一致.B U G N O等系统对比了基于A T P生物发光技术的C e l s i s系统与传统无菌检查法,结果表明,C e l s i s系统的检测限不但和传统无菌检查法无明显差异,而且可以更快地得到阳性结果.C e l s i sA c c e l 系统和C e l s i sA d v a n c e I I TM系统均可在 d内完成无菌检验,可有效促进研发进度和产品的放行速度.合规性方面,C e l s i s微 生 物 快 速 检 测 系 统 也 完 全 符 合F D A C F RP a r t 和欧盟附录 中规定的标准.F D A已于 年批准罗氏公司使用C e l s i s系统替代传统无菌检查法用于多种无菌产品的检查.由密理博公司开发的M i l l i f l e x系统,于 年就已被欧洲药物管理局(E MA)批准为诺华制药公司的无菌检查替代方法.此外,在 年,P a l l c h e k系统曾被F D A批准用于鼻喷雾剂产品(G S K公司)中的微生物检测,是快速微生物检测技术应用于制药行业质量管理的最早案例.流式细胞技术流式细胞技术(f l o wc y t o m e t e rm e t h o d,F CM)仪器一般由流体系统、光学系统和电子系统部分组成.流体系统采用流体动力学聚焦方法将鞘液(通常是缓冲盐水溶液)通过加压的方式将样品输送并聚焦到激光探测点,在激光聚焦点处分析样品.光学系统由激发光学器件(一个或多个激光器)和收集光学器件(光电倍增管或光电二极管)组成,通过作用于细胞样品从而激发出特定荧光信号.电子系统可将来自光探测器的光电信号转换为可由计算机读取的数字信号,以便进行数据分析.流式细胞技术最大特点是快速准确,数据收集及分析时长通常不超过 h,并可排除已死亡或破碎菌体对检测结果的干扰.使用该技术可对样品内微生物数量进行近实时的检测,但F CM的检测限一般大于 c f u,因此在使用F CM进行无菌检验时,需要在检测前富集培养 h,以保证检验结果的准确性.宋光艳等研究了将流式细胞技术应用于注射液及无菌粉末的无菌检查的可行性,结果表明,在使用S Y TO 核素染料对样品中的微生物进行S Y TO 核素染料标记后,流式细胞技术的检验结果与 中华人民共和国药典 中的无菌检查法的结果一致.而且在污染量较低的情况下,检出时间比常规方法可缩短 .卢昕等研究了应用流式细胞技术进行接触镜护理液无菌检验的可行性,并与药典中规定的无菌检查法进行了对比.结果表明,两种方法的检测结果一致,使用F CM法,各种阳性菌均在 h内被检出,且阴性对照未检出微生物生长,在检测时间和灵敏度方面具有明显的优势.等温微量量热技术等温微量量热技术是一种测量密闭容器中热量连续变化的仪器.样品中微生物生长繁殖会产生一定的热量,使用等温量热计可测得热通量.检测时将样品置于安瓿瓶中,安瓿瓶与热通量传感器接触,热通量传感器又与散热片接触,只要反应过程中产生热量或流耗热量,传感图上就会产生一个温度标度并形成电压,此电压与传感器中的热通量以及安瓿瓶中样品的反应速率成正比.通过测量电压值即可计算出反应速率.同时,每种样品都有一个参比样,参比样置于平行式热通量传感器上,在监控热通量的过程中,传入设备的任何温度波动都将对样品传感器和参比传感器产生同等影响,采用这种架构可以非常准确地测定样品自身的热效应,而其他非样品造成的热扰动均会被有效消除.目前等温微量量热技术最低可检测到 c f u微生物生长繁殖所产生的热量,在进行无菌检验时,需要 d的检验周期.任永申等 研究了等温微量量热技术应用于复方茵陈注射液无菌检验的可行标记免疫分析与临床 年月第 卷第期性,结果表明,该方法可在 d内有效检测到各类药品的常见污染菌,且结果具有定量时效性和特征指纹性,有作为微生物鉴定溯源手段的潜力.B RU E C KN E R等 研究了使用等温微量量热技术进行多种单克隆抗体药物无菌检验的可行性,结果表明该方法具有灵敏度高、稳定性高、检测速度快等优点.郜丹等 应用等温微量量热技术开发了快速无菌检查方法,并对各类型注射剂进行了适用性的考察.结果表明,此方法具有良好的灵敏度和耐用性,对微生物的检出限可达到 c f u/m L.核酸扩增技术聚合酶链反应(P C R)是以D NA半保留复制机制为基础发展