基于荧光法及分子对接研究黄褐毛忍冬抑制丙型肝炎病毒NS3_4A蛋白酶活性.pdf

安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)731网络出版时间：2023-04-21 10：31：43 网络出版地址:h t t ps:/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1338.005.h t ml基于荧光法及分子对接研究黄褐毛忍冬抑制 丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶活性杨 欣蔦肖俊伟駕唐婷婷駕危 英駕陈 英駕向良珊彳,周 英彳摘要目的基于荧光实验及分子对接研究黄褐毛忍冬抗 丙型肝炎病毒(HCV)NS3/4A蛋白酶的活性。方法 采用 荧光法测试黄褐毛忍冬提取物抑制HCV NS3/4A蛋白酶活 性，分子对接分析主要活性成分与HCV NS3/4A病毒蛋白酶 结合情况。结果黄褐毛忍冬水提物、醇提物能较好的抑制 HCV NS3/4A蛋白酶活性,半数抑制浓度(IC50)为0.005 0.019 mg/mlo分子对接和相互作用分析发现绿原酸、异绿 原酸A、木犀草昔、木犀草素与HCV NS3/4A蛋白酶结合较 好，可形成多个氢键。结论 初步明确异绿原酸A和木犀 草素是黄褐毛忍冬抗HCV NS3/4A蛋白酶活性的有效成分。关键词 黄褐毛忍冬;HCV NS3/4A蛋白酶;活性测定;分子 对接中图分类号R285文献标志码A 文章编号1000-1492(2023)05-0731-04 d o i:10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.005丙型肝炎是因为感染丙型肝炎病毒(h epa t it is C v ir u s,HCV)引起的慢性疾病，易发展为慢性丙型肝 炎、肝硬化和肝癌，其传播主要与输血有关。HCV 由于病毒株高度变异性导致疫苗的开发变得非常困 难，目前尚无针对HCV的疫苗2。人类使用植物 药治疗疾病已有上千年的历史，一些天然产物显示 出抗病毒的活性,如抗疱疹病毒、流感病毒、获得性 免疫缺陷综合征、乙型肝炎病毒和HCV等卩7。黄 褐毛忍冬(Lonicera,fidvotomentosa Hsu et S.C.Cheng)为忍冬科、忍冬属藤本植物,具有清热解毒,疏散风 热的功效,主治温病发热、热毒血痢、痈肿疔疮等多 种感染性疾病，分布广泛，资源丰富，且产量高。2020版中国药典将其收载为山银花基源植物之2022-12-10 接收基金项目：贵州省教育厅创新群体项目编号:黔教合KY字2021(018)号;贵州省科技计划项目编号:黔科合支撑2020(4Y213)号;国家自然科学基金(编号=81760758)；中药、民族药活性评价及药效分子构建研究中心项目(编号:34114110000520364)作者单位:贵州中医药大学|基础医学院、2药学院，贵阳550025 作者简介:杨 欣，女，博士，副教授,责任作者,E-ma il:w eiy in g l 969126.c o m 一，该药材在民间常用于代茶饮,其水煎剂或醇 提物已制成药，如双黄连注射液、银黄注射液等已作 为抗病毒药物广泛应用于临床。该研究采用荧光法 和分子对接技术检测黔产道地药材黄褐毛忍冬抗 HCV NS3/4A蛋白酶活性，拟期从中药、民族药中发 现更多的抗病毒药效物质，阻断HCV的复制。1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验药材来源 黄褐毛忍冬药材于2016年 3月采自贵州兴义，由贵州中医药大学陈德媛教授 鉴定为 Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng,植 物标本存放在贵州中医药大学科研楼中药民族药活 性筛选实验室(标本号为LF201607)o1.1.2 实验试剂 HCV NS3/4A蛋白酶、HCV蛋 白酶试剂盒购自美国An a Spec公司;信筒子醞购自 美国Sig ma Al d r ic h公司;绿原酸、异绿原酸A、木犀 草昔、木犀草素、灰毡毛忍冬昔乙购自成都德锐可生 物有限公司，样品纯度M98%。1.1.3 实验仪器Sy n er g y D酶标仪购自美国Bio Tec h公司，分析天平MS205DU购自瑞士 Met d er To l ed o公司,384孔板购自美国Co min g公司，Mil i-Q 系统超纯水购自美国MiUipo r e公司，DMSO购自北 京索莱宝科技有限公司。1.2方法1.2.1 黄褐毛忍冬不同提取物及主要活性成分 取黄褐毛忍冬药材25 g,共4份，粉碎，分别加250 ml的蒸憎水、30%甲醇、60%甲醇、85%甲醇，超声2 min后，加热回流提取3次，第1、2次回流提取1 h,第3次回流提取30 min,合并提取液,减压浓缩成浸 膏，真空干燥，采用UP LC-HRMS技术对黄褐毛忍冬 水提物及不同醇提物的化学成分变化情况进行研 究。结合对照品比对、液质提供的精确分子量和 多级质谱碎片离子信息进行定性分析，根据Lipin sk i 类药五原则进行筛选。1.2.2 荧光法检测HCV NS3/4A蛋白酶抑制试验 以黄褐毛忍冬水提物、30%醇提物、60%醇提物、732安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)85%醇提取物为研究样本,采用荧光法测定样品抑 制HCV NS3/4A蛋白酶活性。具体操作：10以 底物（用1:100实验缓冲溶液稀释Co mpo n en t A）与2 pl抑制剂混合，然后加入8,11酶（0.5|ig/ml）于384孔板,反应混合物在37七卵孵30 min,在 Em/Ex为490 n m和520 n m下检测荧光。信筒子醞 作为阳性对照运用于同一试验中，每个样品测试3 次。抑制率计算公式:抑制率=100 X（Fv eh ic l e-Fsa mpl e）/Fv eh ic l e；式中的F为对照组和样品组荧 光值。Gr a ph pa d P r ism计算半数抑制浓度（h a l f ma xima l in h ibit o r y c o n c en t r a t io n,IC50），数据以 x s 表 示,计量资料采用STDEVy检验计算抑制率。1.2.3受体与配体文件准备 从蛋白质晶体结构 数据库 RCSB（h t t p:/w w w.r c sb.o r g/pd b）获取 HCV 蛋白酶（P DB ID：1NS3）O 利用 SYBYI2.1.1 对蛋白晶体结构进行抽离配体、删除水分子、加氢、修复侧链氨基酸、加电荷、提取配体等前处理，保存 备用;运用SYBYL2.1.1构建黄褐毛忍冬主要活性 成分配体库并完成分子优化，设置参数：选择 Ga st eig er Hu c k el电荷，采用Tr ipo s力场，最大迭代系 数设置为10 000,其它参数均设为默认值。1.2.4 SYBYL 2.1.1分子对接实验 基于 SYBYI2.1.1的Do c k in g Su it e模块,读取已生成的 受体SFXC格式文件开始对接工作。实验结果以 总分5为阈值，采用Lig pl o t l.4.5软件进行相互作 用分析。实验结果以氢键、疏水作用和结构比对输 出，筛选关键的氨基酸位点。1.2.5实验验证分析 采用荧光法验证6个黄褐 毛忍冬中主要成分（绿原酸、异绿原酸A、木犀草昔、木犀草素、灰毡毛忍冬昔乙和常春藤皂昔元）抑制 HCV NS3/4A蛋白酶的活性1-13o使用Sen-so Ly t eTM 520荧光HCV NS3/4A蛋白酶试剂盒，操 作方法与前面实验保持一致性。2 结果2.1黄褐毛忍冬不同溶剂提取物体外抑制HCV NS3/4A蛋白酶活性 在浓度为1.0,0.1和0.01 mg/ml时，黄褐毛忍冬不同溶剂提取物对HCV NS3/4A蛋白酶具有不同程度的抑制作用（表1）,Go值范围为0.005 0.019 mg/ml,其中黄褐毛忍 冬60%醇提物显示较强的抗HCV NS3/4A蛋白酶 的活性。2.2配体优化绿原酸、异绿原酸A、木犀草昔、木 犀草素、灰毡毛忍冬昔乙、常春藤皂昔元6个活性成 分可遵循Lipin s k i类药五原则。基于SBYBL对黄 褐毛忍冬活性成分进行优化，图1A为未优化的活 性成分棒状模型（St ic k s），共有6个配体，红色代表 氢原子，蓝色代表氧原子。对小分子配体进行基于 Tr ipo s力场的能量最小化计算,优化分子结构,获得 合理构象（图1B）。表1黄褐毛忍冬不同溶剂提取物体外抑制HCV NS3/4A蛋白酶活性Gs,n=3）样品名称抑制率（）IC50(mg/r n l)1.0 mg/ml0.1 mg/ml0.01 mg/ml黄褐毛忍冬水提物92.02 1.6572.76 6.0447.70 2.820.013 0.003黄褐毛忍冬30%醇提物92.54 2.3782.75 3.9035.70 2.190.019 0.003黄褐毛忍冬60%醇提物93.03 2.1979.84 1.1058.10 5.480.005 0.003黄褐毛忍冬85%醇提物99.52 0.2879.31 1.0249.50 3.010.010 0.001信筒子醞（阳性对照）123.28 0.38105.92 1.3373.10 2.460.008 0.003AB图1黄褐毛忍冬主要活性成分优化A：未优化的活性成分棒状模型；B：优化的活性成分棒状模型安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)7332.3受体优化 基于P DB数据库下载HCV蛋白 酶结构见图2A,Reso l u t io n：2.80入，通过SYBYL去 水、加全氢、加电子，选择Lig a n d（B/ZN690）模式形 成口袋。图2B绿色区域为对接口袋的位置，是受 体中配体结合的区域。个氢键（Gl y l 37、Ly sl 36、Cy sl 59、His57、Sei42、Ar g l 56、Th r 40）；木犀草昔与HCV结合后形成2个 氢键（Ly sl 36、Gl n 41）；木犀草素与HCV结合后形成 1个氢键（Gl n 41）；信筒子醞与HCV结合后形成3 个氢键（Sei42、Ly sl 36、Th i40）。B2图2 HCVNS3/4A蛋白酶优化及结合口袋A：P DB数据库下载HCV蛋白酶结构；B：对接口袋的位置表2黄褐毛忍冬主要活性成分与HCV蛋白酶分子对接化合物歼式分子量CAS号总分绿原酸16日日18。9354.31202650-88-26.5异绿原酸A。25日日24。12516.4089919-62-06.6木犀草昔。21日日2()01144&405373-11-55.8木犀草素15106286.24491-70-37.0灰毡毛忍冬皂昔乙65 106321 399.53136849-88-2-1.2常春藤皂昔元。30日日48。4472.70465-99-63.1信筒子醞（阳性对照）17264294.40550-24-37.12.6荧光法测试黄褐毛忍冬主要化合物抗HCV NS3/4A蛋白酶活性 在浓度为0.01 mg/ml时，结 果显示均具有抑制HCV蛋白酶活性（表3）,其中异 绿原酸A和木犀草素对HCV NS3/4A蛋白酶抑制 率分别为60.5%和43.1%。异绿原酸A、木犀草素 的瓦5。值分别为 0.008 mg/ml 和 0.019 mg/ml o表3黄褐毛忍冬主要活性成分 抑制HCV NS3/4A蛋白酶活性5=3）化合物CAS号分子量抑制率（）绿原酸202650-88-2354.3135.23 8.08异绿原酸A89919-62-0516.4060.51 4.85木犀草昔5373-11-5448.4038.02 5.70木犀草素491-70-3286.2443.19 2.03灰毡毛忍冬皂昔乙136849-88-21 399.5316.63 3.48常春藤皂昔元465-99-6472.7035.62 3.4