羔羊大肠杆菌分离鉴定及其致病性、耐药表型和耐药基因检测.pdf

安徽科技学院学报,2 0 2 3,3 7(3):2 3-2 9 J o u r n a l o fA n h u iS c i e n c ea n dT e c h n o l o g yU n i v e r s i t y 收稿日期:2 0 2 2-0 9-2 0基金项目:安徽省现代农业产业技术体系建设专项资金(皖农科2 0 2 17 1 1号);安徽科技学院乡村振兴专项(2 0 2 1 X C Z X 0 5);安徽科技学院发展基金项目(F Z 2 2 0 1 4 0);安徽省高校协同创新项目(G X X T-2 0 1 9-0 3 5)。作者简介:王康(1 9 9 1-),安徽阜阳人,硕士研究生,主要从事羊致病菌地区流行特性与病原分子学特性研究。通信作者:贺绍君,教授,E-m a i l:s h a o j u n h e 2 0 1 11 2 6.c o m。羔羊大肠杆菌分离鉴定及其致病性、耐药表型和耐药基因检测王 康1,2,邓亚飞1,2,孙诗昂1,2,李 冰1,2,张留君1,2,辛洪雷3,路振香1,2,贺绍君1,2*(1.安徽科技学院 动物科学学院,安徽 凤阳 2 3 3 1 0 0;2.动物营养调控与健康安徽省重点实验室,安徽 凤阳 2 3 3 1 0 0;3.安徽省临泉县中原牧业发展中心,安徽 临泉 2 3 6 4 0 0)摘 要:目的:对皖北地区羊养殖场中所采集的3 7份腹泻羔羊粪便样本进行病原菌的分离鉴定,并对其耐药性及耐药基因进行测定。方法:将采集样本进行病原菌分离鉴定并进行同源性分析,通过药敏试验测定分离菌药物敏感性并对其耐药基因进行检测。结果:试验分离细菌3 7株,经生长特性、生化鉴定及1 6 Sr R N A测序对比序列确定分离菌均为大肠杆菌。致病性检测大肠杆菌中有2 1株为产志贺毒素大肠杆菌,其中S t x-1毒力基因和S t x-毒力基因分别占比8.1 0%和4 8.6 5%,肠毒性大肠埃希杆菌在本次试验中未检出。对分离的大肠杆菌进行耐药基因检测,6组耐药基因中t e t A(9 7.3 0%)和q n r(8 3.7 8%)检出率较高。药敏结果显示分离的大肠杆菌对复方新诺明和林可霉素的耐药率分别达到8 9.1 9%和9 4.5 9%。结论:皖北地区部分大肠杆菌存在致泻性、携带多种耐药基因、存在多重耐药情况。关键词:大肠杆菌;分离鉴定;致病性;药敏试验;耐药基因中图分类号:S 8 5 2.3文献标志码:A文章编号:1 6 7 3-8 7 7 2(2 0 2 3)0 3-0 0 2 3-0 7开放科学(资源服务)标识码(O S I D):D O I:1 0.1 9 6 0 8/j.c n k i.1 6 7 3-8 7 7 2.2 0 2 3.0 0 3 9I s o l a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o n,p a t h o g e n i c i t y,d r u gr e s i s t a n c ep h e n o t y p ea n dd r u gr e s i s t a n c eg e n ed e t e c t i o no fE s c h e r i c h i ac o l if r o ml a m b sWANGK a n g1,D E NGY a f e i1,S UNS h i a n g1,L IB i n g1,Z HANGL i u j u n1,2,X I N H o n g l e i3 L UZ h e n x i a n g1,2,HES h a o j u n1,2*(1.C o l l e g eo fA n i m a lS c i e n c e,A n h u iS c i e n c ea n dT e c h n o l o g yU n i v e r s i t y,F e n g y a n g2 3 3 1 0 0,C h i n a;2.A n h u iP r o v i n c eK e yL a b o r a t o r yo fA n i m a lN u t r i t i o n a lR e g u l a t i o na n dH e a l t h,F e n g y a n g2 3 3 1 0 0,C h i n a;3.A n h u iP r o v i n c eL i n q u a nC o u n t yZ h o n g y u a nA n i m a lH u s b a n d r yD e v e l o p m e n tC e n t e r,L i n q u a n2 3 6 4 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e:T oi s o l a t ea n di d e n t i f yt h ep a t h o g e n i cb a c t e r i af r o m3 7f e c a ls a m p l e so fd i a r r h e al a m b sc o l l e c t e df r o m s h e e pf a r m si nn o r t h e r n A n h u i,a n dt od e t e r m i n et h e i rd r u gr e s i s t a n c ea n dr e s i s t a n c eg e n e s.M e t h o d s:T h ec o l l e c t e ds a m p l e sw e r ei s o l a t e d,i d e n t i f i e d,a n dh o m o l o g o u sa n a l y s i sw a sp e r f o r m e d.T h ed r u gs e n s i t i v i t yo ft h ei s o l a t e db a c t e r i aw a sd e t e r m i n e dt h r o u g hd r u gs e n s i t i v i t yt e s t i n g,a n d t h e i r d r u g r e s i s t a n c eg e n e sw e r ed e t e c t e d.R e s u l t s:3 7s t r a i n s o f b a c t e r i aw e r e i s o l a t e d i n t h ee x p e r i m e n t.A f t e rg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c s,b i o c h e m i c a li d e n t i f i c a t i o n,a n d1 6 Sr R NAs e q u e n c i n ga n dc o m p a r i s o n,i tw a sd e t e r m i n e dt h a t t h e i s o l a t e db a c t e r i aw e r ea l lE s c h e r i c h i ac o l i.I nt h ep a t h o g e n i c i t yt e s t,2 1s t r a i n so fE.c o l iw e r eS h i g a t o x i np r o d u c i n gE.c o l i,o fw h i c ht h eS t x-1a n dS t x-I Iv i r u l e n c eg e n e sa c c o u n t e df o r8.1 0%a n d4 8.6 5%r e s p e c t i v e l y.E n t e r o t o x i cE.c o l iw a sn o td e t e c t e d i nt h i s t e s t.T h ed e t e c t i o nr a t e so ft e t A(9 7.3 0%)a n dq n r(7 5.6 8%)i nt h es i xg r o u p so fd r u gr e s i s t a n tg e n e s i ni s o l a t e dE.c o l iw e r eh i g h e r.T h ed r u gs e n s i t i v i t yr e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r e s i s t a n c e r a t e so f t h e i s o l a t e dE.c o l it oc e f o t a x i p h e n ea n d l i n c o m y c i nw e r e8 6.4 9%a n d9 4.5 9%,r e s p e c t i v e l y.C o n c l u s i o n:S o m eE.c o l is t r a i n s i nN o r t h e r nA n h u ih a v ed i a r r h e a,c a r r ym u l t i p l ed r u gr e s i s t a n c eg e n e s,a n dh a v em u l t i p l ed r u gr e s i s t a n c e.K e y w o r d s:E s c h e r i c h i a c o l i;I s o l a t i o n a n di d e n t i f i c a t i o n;P a t h o g e n i c i t y;D r u g s e n s i t i v i t y t e s t;R e s i s t a n c eg e n e s羔羊腹泻是羊养殖过程中常见的消化道疾病,严重影响羔羊的生长、发育和存活1,给养羊业造成严重经济损失。诱发羔羊腹泻的因素主要包括细菌、病毒、寄生虫感染,饲养及管理不当等2。在诸多因素中,大肠杆菌感染致羔羊腹泻最为常见3。大肠杆菌病主要用抗生素防治,但其耐药问题是公共卫生面临的最大威胁之一,大肠杆菌的多重耐药性的快速增长在人类医学及畜牧业均有广泛报道4-5。本研究以2 0 2 1年1 2月2 0 2 2年6月安徽省部分地区羊养殖场所采集的腹泻羔羊粪便为样本,对其进行大肠杆菌的分离培养、革兰染色镜检、生化试验、1 6 Sr R NA测序及同源性分析;再对其致病性及耐药基因进行检测,药敏试验筛选出敏感抗生素。本试验为安徽部分地区大肠杆菌病的有效预防、实验室诊断及科学规范临床用药提供指导。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病料 皖北地区7个羊场1 0周龄以内的山羊或湖羊腹泻羔羊粪便样本3 7份,样本均为稀便或水样便。1.1.2 试剂 药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司(生产批号:2 0 2 2 0 2 1 4);M a s t e r m i x购自莫纳(苏州)生物科技有限公司。1.2 方法1.2.1 病原菌的分离纯化与革兰染色镜检 粪便样本分别接种于麦康凯琼脂、普通营养琼脂培养基,3 7恒温隔夜培养,挑取培养出的单个典型菌落纯化,革兰染色后镜检,每个样本3个重复试验。1.2.2 生化试验 参考彭严严等6的试验方法,用纯化后的分离菌进行8种不同生化试验。1.2.3 D NA模板的制备 用接种环取分离纯化后的典型菌落于1 0 0L超纯水中,混匀,采用水煮法提取细菌D NA,-2 0保存备用。1.2.4 1 6 S rR NA P C R扩增与序列测定 参照细菌的通用引物,上游引物F序列:5-AGAG T T