毛白杨碱性_中性转化酶基因PtoNIN1的克隆与功能研究.pdf

DOI:10.12171/j.10001522.20220171毛白杨碱性/中性转化酶基因PtoNIN1 的克隆与功能研究杨宁杨雄李国雷陈仲(北京林业大学林学院，省部共建森林培育与保护教育部重点实验室，北京100083)摘要:【目的】蔗糖转化酶作为植物蔗糖代谢过程中的关键酶，在植物生长发育过程中发挥着重要作用。本研究对毛白杨碱性/中性转化酶基因 PtoNIN1 进行同源基因克隆、生物信息学分析、基因表达分析和遗传转化研究，以期为进一步揭示毛白杨蔗糖代谢调控过程奠定基础。【方法】基于毛果杨同源基因 PtrNIN1 对毛白杨碱性/中性转化酶成员 PtoNIN1 进行同源克隆和生物信息学分析，采用实时荧光定量 PCR 的方法对不同组织部位（根、茎、叶和成熟叶）和不同发育时期下雌雄花芽中 PtoNIN1 的基因表达量进行分析，同时构建过表达载体，并对模式植物拟南芥开展遗传转化研究。【结果】PtoNIN1的编码区长度为 2073bp，共编码 690 个氨基酸，蛋白分子量为 77.80kDa，含有糖苷酶超家族 100（glycosyl-hydrolase-100superfamily）的特征结构域，类属于线粒体型的转化酶成员，在根、茎、叶以及成熟叶和雌雄花芽中均具有明显表达，且随着雌雄花芽的发育呈现先下降后保持稳定的表达趋势。拟南芥遗传转化研究表明：PtoNIN1 的过表达显著增加了转基因植株莲座叶、茎及角果的鲜质量，提高了茎及角果中蔗糖的含量，同时也提高了蔗糖代谢通路其他关键基因的表达。【结论】毛白杨 PtoNIN1 属于线粒体型转化酶家族成员，在毛白杨各个组织部位均具有明显表达，且在雌雄花芽的发育前期具有特异地高表达，在拟南芥中过表达 PtoNIN1 可显著增加生物量。该研究为杨树转化酶成员功能验证提供了借鉴，为揭示杨树蔗糖代谢过程奠定了基础。关键词：毛白杨；碱性/中性转化酶；基因克隆；表达模式分析；遗传转化中图分类号：S792.11文献标志码：A文章编号：10001522(2023)05003512引文格式：杨宁，杨雄，李国雷，等.毛白杨碱性/中性转化酶基因 PtoNIN1 的克隆与功能研究 J.北京林业大学学报，2023，45(5)：3546.YangNing,YangXiong,LiGuolei,etal.Cloningandfunctionalstudyofthealkaline/neutralinvertasegenePtoNIN1inPopulus tomentosaJ.JournalofBeijingForestryUniversity,2023,45(5):3546.Cloning and functional study of the alkaline/neutral invertase gene PtoNIN1 inPopulus tomentosaYangNingYangXiongLiGuoleiChenZhong(SchoolofForestry,KeyLaboratoryofSilvicultureandConservationofMinistryofEducation,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China)Abstract:ObjectiveSucroseinvertase,asakeyenzymeinplantsucrosemetabolism,playsanimportantroleinplantgrowthanddevelopment.Inthisstudy,PtoNIN1,analkaline/neutralinvertase,wasselectedtododetailedanalysis,includinggenecloning,bioinformatics,geneexpressionandgenetictransformationanalysis,andtheseresultswerehelpfulforclarifyingthemechanismofsucrosemetabolisminPopulustomentosa.MethodPtoNIN1wasobtainedthroughthehomologouscloningofPtrNIN1inP.trichocarpa,andthenbioinformaticsanalysisforPtoNIN1wascarriedout.GeneexpressionofPtoNIN1wasconductedatdifferentorgans(leaf,stem,rootandmatureleaves)anddifferentdevelopmentalstagesofmaleandfemaleflowerbuds.AndoverexpressionvectorofPtoNIN1wasconstructedtocarryoutgenetictransformation收稿日期:20220504修回日期:20220520基金项目:国家自然科学基金项目（31800555）。第一作者:杨宁。主要研究方向：植物基因组学、分子生物学。Email：地址：100083北京市海淀区清华东路 35 北京林业大学林学院。责任作者:陈仲，副教授。主要研究方向：林木栽培生理与功能基因组学。Email：地址：同上。本刊网址:http:/；http:/第45卷第5期北京林业大学学报Vol.45，No.52023年5月JOURNALOFBEIJINGFORESTRYUNIVERSITYMay，2023researchonthemodelplantArabidopsis thaliana.ResultThecodingregionofPtoNIN1was2073bpinlength.ThePtoNIN1proteincontained690aminoacids,anditsmolecularmasswas77.80kDa.PtoNIN1containedaspecificdomainofglycosylhydrolasesupergenefamily100.Thephylogeneticanalysisshowedthatitisthememberofmitochondrial-typeinvertasecluster.PtoNIN1waswidelyexpressedintheplant,includingroots,stems,leaves,matureleaves,maleandfemaleflowerbuds.Thereinto,thedevelopmentstageofmaleandfemaleflowerbudshadaninfluenceontheexpressionofPtoNIN1.GenetictransformationstudiesinArabidopsisshowedthatoverexpressionofPtoNIN1significantlyincreasedthefreshmassofrosetteleaves,stemsandsiliques.Thesucrosecontentsinstemsandsiliquesoftransgenicplantswerealsosignificantly increased.And higher expression patterns of other sucrose metabolism-related genes werefoundintransgenicplantswhencomparedwithwild-typeplant.ConclusionPtoNIN1isthememberofmitochondrial-typeinvertasesinP.tomentosa.Itiswidelyexpressedinvarioustissuesofpoplar,andhasaspecificexpressionintheearlydevelopmentalstageofmaleandfemaleinflorescences.OverexpressionofPtoNIN1 in Arabidopsis can significantly increase plant biomass accumulation.This study provides areferenceforthefunctionalverificationofotherinvertasesinpoplar,andlaysafoundationforrevealingthesucrosemetabolicprocessofpoplar.Key words:Populus tomentosa;alkaline/neutral invertase;gene cloning;expression pattern analysis;genetictransformation蔗糖代谢在植物生长发育过程中发挥着重要的调控作用。作为植物中重要的碳源存储形式之一，蔗糖的合成和代谢过程倍受研究者们的关注。其中蔗糖合成过程主要由蔗糖磷酸合酶（sucrosephosphatesynthase，SPS）和蔗糖磷酸化酶（sucrosephosphorylase，SPP）进行调控，而蔗糖合酶（sucrosesynthase，SUS）调控蔗糖与 UDP-葡萄糖和果糖间的可逆合成和分解过程，蔗糖转化酶（invertase，INV）则不可逆地调控蔗糖分解形成葡萄糖和果糖12。蔗糖转化酶作为蔗糖分解过程中的关键酶，按照其在植物细胞内分布部位的不同，可分为液泡转化酶（vacuolarinvertase，VIN）、细胞壁转化酶（cellwallinvertase，CWIN）和胞质转化酶（cytoplasmicinvertase，CINV）3 类；按照其 pH 值的不同，细胞壁转化酶和液泡转化酶又被称为酸性转化酶（acidinvertase，AIN），而胞质转化酶则被称为碱性/中性转化酶（alkaline/neutralinvertase，NIN）3。因二者进化来源不一，碱性/中性转化酶与酸性转化酶的同源性较低4，其中碱性/中性转化酶类属于糖基水解酶家族 100，主要定位于叶绿体、线粒体和胞质溶胶内，与植物的生长发育和胁迫响应相关57。前人对于拟南芥（Arabidopsis thaliana）的研究表明：碱性/中性转化酶在植物的生长发育过程中发挥着重要的调控作用1。在拟南芥中，碱性/中性转化酶基因家族共包含 9 个成员，其中 AtCINV1（cytoplasmic invertase1）调控拟南芥根形态的正常发育，抑制其表达会抑制主根生长和促进侧根的发育89；AtINVE（alkaline/neutral invertase E）则参与拟南芥叶绿体的发育，抑制其表达不仅造成叶绿体发育畸形且提高了植株的氮同化速率10；AtINVH（alkaline/neutral invertase H）则在拟南芥再生组织部位中具有特异地高表达，其突变体表现出茎缩短、开花时间延迟等特性，且其根部中的活性氧（ROS）水平急剧下降11。此外，在百脉根（Lotus japonicus）中，LjINV1（alkaline/neutral invertase1）基因的突变会导致植株根和茎长度的缩短，且无花粉产生，影响植株的生殖发育12。在巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）中，转化酶活性则与乳胶的产量紧密关联13。水稻（Oryza sativa）中 OsCYT-INV1（cytoplasmic invertase1）基因的突变则会导致根长的缩短和开花时间的延长以及不育14。在杂交山杨（Populus tremula tremuloides）中，转化酶的活性则与纤维素合成相关，其活性的下降会导致纤维素含量的下降，影响植物的次生生长15。此外，碱性