苯甲酸钠对青春期小鼠肝脏的影响.pdf

通信作者：石慧，：苯甲酸钠对青春期小鼠肝脏的影响孔令英赵振军李岩刘笑含许文达董思林石慧烟台大学生命科学学院生殖发育实验室山东 烟台 【摘要】目的探讨苯甲酸钠对青春期小鼠肝脏发育的影响及机制。方法将 周龄雄性小鼠分为苯甲酸钠低剂量（）、中剂量（）、高剂量（）和生理盐水组，经口灌胃至青春早期（周龄）、青春中期（周龄）、青春晚期（周龄）。称量小鼠体质量和肝脏组织重量，计算脏器系数，组织切片经 染色后进行病理观察，检测丙二醛（）含量和超氧化物歧化酶（）活力评估肝脏氧化损伤情况，采用 法检测细胞凋亡情况，通过荧光定量 测定凋亡相关基因表达。结果与生理盐水组比较，苯甲酸钠各剂量组小鼠体质量、肝脏系数均降低。苯甲酸钠各剂量组小鼠的肝细胞索结构紊乱，中央静脉和肝小叶等结构被破坏。苯甲酸钠各剂量组小鼠的肝脏 含量升高，活力下降，肝细胞凋亡率显著增加，肝脏 和 基因表达上调，基因表达下调。结论苯甲酸钠可对小鼠肝脏造成较严重损伤，且呈剂量依赖性，机制可能为苯甲酸钠导致肝细胞发生氧化损伤，进而诱发 基因介导的线粒体途径的凋亡。【关键词】苯甲酸钠；肝脏；发育；氧化损伤；凋亡【中图分类号】【文献标志码】【文章编号】（）：，【】（），（）（），（），（），（）；，；，；，【】；苯甲酸钠（），又称为安息香酸钠，是苯甲酸衍生物。苯甲酸钠易溶于水，可以通过细胞膜酸化细胞内的储备碱，抑制细胞呼吸酶系活性，从而对酵母菌和细菌有良好的抑制作用 。苯甲酸钠的价格低廉 ，在食品、药品、饲料、化妆品等行业得到广泛使用。近几年，我国苯甲酸钠的滥用、超标现象已引起广泛关注。杨朝菊等 检测宜宾市的市售咸菜发现，苯甲酸钠检测合格率仅为 。方田田等 检测东莞市腌制蔬菜发现，苯甲酸钠的合格率仍低于 。常炯炯等 对我国食品添加剂的使用情况进行调查，发现青少年儿童组的苯甲酸钠暴露量高于其他年龄组，更容易出现滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，摄入过量的问题。高浓度的苯甲酸钠具有细胞毒性，能够破坏细胞膜的有序结构，引起染色体畸变 、精子畸形 ，卵巢细胞凋亡率增加 等，即苯甲酸钠具有致畸性和生殖毒性。苯甲酸钠主要在肝脏中进行代谢，高浓度的苯甲酸钠可导致大鼠肝脏出现炎症和丙二醛（，）含量显著增加 。另外，苯甲酸钠还具有神经毒性，长期饮用含苯甲酸钠的饮料会引起慢性苯中毒，可能导致儿童多动症 。因此，研究苯甲酸钠的安全使用剂量以及苯甲酸钠对哺乳动物发育，特别是青春期发育的影响至关重要。我国食品安全国家标准规定，苯甲酸钠在食品中最大使用量为 。小鼠在 周龄时离乳进入青春期，青春期又分为青春早期（周龄），青春中期（周龄）和青春晚期（周龄）三个阶段 。本研究选取青春早期（周龄）的雄性小鼠为研究对象，初步探讨不同剂量苯甲酸钠对青春期小鼠肝脏的影响，为研究苯甲酸钠对青春期儿童生长发育的影响，以及其在食品和药品等行业添加应用标准的制定提供理论依据。材料与方法 实验材料苯甲酸钠购自源叶生物公司，货号为 。级 周龄 雄性小鼠 只，体质量为 ，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物许可证号为 （鲁），质量合格证流水号为 。小鼠分笼饲养，光 暗周期 ，自由进食和饮水。动物房温度为 ，相对湿度为 。实验动物分组选取 只 周龄雄性小鼠，适应性喂养 后随机分为 组，每组 只。根据我国食品安全国家标准规定苯甲酸钠在食品中最大使用量为 ，设置苯甲酸钠低剂量（）、中剂量（）、高剂量（）和生理盐水四个处理组。各组按照 小鼠体质量的溶液体积每天分别灌胃不同剂量的苯甲酸钠和生理盐水，分别在灌胃 、和 周后各处死 只，取样进行相关检测，相当于处死小鼠分别为 、和 周龄。本研究动物实验经过烟台大学动物伦理委员会审查批准（批准号为 ）。实验方法 不同周龄小鼠体质量、肝脏发育情况检测对各组小鼠每天进行体质量称重并记录。各组小鼠断颈法处死后称重，并取出肝脏组织称量质量，计算脏器系数（脏器系数 器官质量 体质量 ）。肝脏组织 染色取 、周龄小鼠的肝脏固定包埋切片，经 染色处理后在显微镜上观察并拍照，图片采用 软件处理。肝脏组织氧化损伤测定采用南京建成 测试盒（法）、超氧化物歧化酶（，）试剂盒（法）测定肝脏组织的氧化损伤情况和抗氧化能力。法检测肝脏组织凋亡采用碧云天一步法 细胞凋亡检测试剂盒，对 、周龄的小鼠肝脏切片进行凋亡检测，每张切片选取 个不同视野进行后续分析。实时荧光定量 检测凋亡相关基因表达采用碧云天动物 抽提试剂盒和 合成试剂盒提取小鼠总 ，并合成 第一条链，使用生工生物公司提供的引物（表 ）在 反应混合物体系中通过荧光定量 仪检测 、和 基因表达。该反应混合物体系包含 、正向和反向引物各 （）、水 和 模板 。条 件 如 下：，然 后 ，（）（）（），进行 次循环。作为内参基因，用 法计算基因相对表达量，结果表示为靶基因 的相对数量。表 凋亡相关基因引物序列基因引物序列（）扩增长度 滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，统计学方法使用 软件进行处理，定量资料以（珋 ）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时采用 检验，方差不齐时用 检验。为差异有统计学意义。结果 不同周龄小鼠体质量、肝脏发育情况使用不同浓度的苯甲酸钠处理对小鼠的发育有明显的影响。低、中、高剂量组 、周龄小鼠的体质量均低于生理盐水组，。当灌胃至 、周时，高剂量组小鼠体质量低于低剂量组，（图 ）。与生理盐水组比较，；与低剂量组比较，。图 小鼠体质量增长柱状图当灌胃 周后，中、高剂量组的 周龄小鼠肝脏系数显著低于生理盐水组，而 周龄小鼠的肝脏系数趋于正常；但当灌胃 周时，中、高剂量组的 周龄小鼠肝脏系数又显著低于生理盐水组，。表 不同周龄各组剂量处理后的小鼠肝脏系数（，珋 ）组别例数 周龄 周龄 周龄生理盐水组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 注：与生理盐水组比较，。肝脏组织 染色切片结果灌胃 周后，各苯甲酸钠处理组的 周龄小鼠肝脏的肝小叶结构清晰，肝细胞索排列有序，未见明显病变表现。灌胃 周后，低剂量组的 周龄小鼠表现与生理盐水组相似，而中剂量组的肝细胞索部分消失，排列紊乱，高剂量组肝细胞胞浆疏松化，门管区散在性炎细胞浸润。灌胃 周后，低剂量组的 周龄小鼠的胞浆出现轻微的空泡化，炎性细胞积聚，中剂量组和高剂量组的小鼠肝脏的中央静脉和肝小叶结构破裂、肝索断裂和充血，胞浆空泡化、双核化和核固缩，出现大量炎性细胞，肝脏损伤严重（图 ）。生理盐水组；低剂量组；中剂量组；高剂量组。粗箭头表示炎性细胞，细箭头表示肝细胞胞浆疏松，呈空泡化状态。图 小鼠肝脏 染色切片（）肝脏组织 含量和 活力测定灌胃 周后，与生理盐水组相比，中、高剂量组 周龄小鼠的肝脏 含量增加，。灌胃 周后，中、高剂量组 周龄小鼠的肝脏 含量增加，。灌胃 周后，中、高剂量组 周龄小鼠的肝脏 含量增加，（表 ）。与生理盐水组相比，高剂量组 周龄小鼠和中、高剂量组 周龄小鼠的肝脏 的活力均减少，（表 ）。表 不同周龄各组小鼠的肝脏 含量（，珋 ）组别例数 周龄 周龄 周龄生理盐水组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 注：与生理盐水组比较，。表 不同周龄各组小鼠的肝脏 活力（，珋 ）组别例数周龄周龄周龄生理盐水组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 注：与生理盐水组比较，。肝脏组织凋亡情况苯甲酸钠中、高剂量组小鼠的肝脏细胞出现了明显的凋亡。如图 所示，灌胃 周后，生理盐水组和低剂量 周龄小鼠的肝脏细胞几乎没有凋亡信号，但中、高剂量组可见明显的滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，凋亡信号。灌胃 周后，生理盐水组和低剂量组 周龄小鼠的肝脏细胞可见少许的凋亡信号，中、高剂量组信号显著强于另外两组，尤其是高剂量组的中央静脉附近出现大量凋亡的肝细胞。灌胃 周后，生理盐水组和低剂量组 周龄小鼠几乎无凋亡信号，而中、高剂量组凋亡信号依旧强烈。生理盐水组；低剂量组；中剂量组；高剂量组。图 小鼠肝脏凋亡检测图（绿色荧光，）肝脏凋亡相关基因表达结果如图 所示，与生理 盐 水 组 相 比，低、中、高 剂 量 组 的 和 表达均增加（或 ）。除中剂量组 周龄小鼠的 表达和生理盐水组比较，差异无统计学意义外，其他各组不同周龄小鼠的 基因表达均降低（或 ）。与生理盐水组比较，。图 肝脏凋亡相关基因相对表达量图（）讨论苯甲酸钠属于低毒性物质，当人体短期内摄入少量的苯甲酸钠时，后即可完全排出 ，但苯甲酸钠也具有蓄积毒性 ，如果长期服用过量苯甲酸钠，将对人体各组织和器官产生危害。本研究发现，以低、中、高剂量苯甲酸钠灌胃处理小鼠后，各苯甲酸钠处理组 、周龄小鼠的体质量均低于生理盐水组。另外，中、高剂量组 、周龄小鼠的肝脏系数也低于生理盐水组。近些年来，欧共体儿童保护集团认为苯甲酸钠不宜用于儿童食品中，日本等国家也禁止在饮料中添加苯甲酸钠，但苯甲酸钠仍在我国碳酸饮料品牌代工厂中使用。我国食品安全国家标准规定，苯甲酸钠在食品中最大使用量为 。本研究显示，即使是 食品安全国家标准规定剂量，如果连续摄入 周以上，对小鼠的生长发育也具有显著的影响。这提示，苯甲酸钠的使用不但要关注单次摄入安全剂量，还要考虑其蓄积毒性。本研究进一步探讨苯甲酸钠对青少年的安全性问题，建议采用毒性更低的山梨酸钾或者新型的更为天然的生物类食品防腐剂替代。肝脏是物质代谢的主要场所，也是重要的解毒器官和消化腺，其新陈代谢能力与胃肠道功能紧密相关 。高浓度的苯甲酸钠可破坏胃肠道粘膜，使得其消化和吸收能力下降，进而影响了肝脏的发育。肝脏具有强大的再生能力，只需其完全体积的 即可完成再生 ，因此，本研究推测由于苯甲酸钠导致 周龄小鼠胃肠功能受损，进而影响肝脏发育，但是由于肝脏强大的再生能力，其在 周龄时逐渐恢复至正常系数。随着灌胃时间延长，苯甲酸钠毒性蓄积，小鼠肝脏系数在 周龄时又呈显著下降趋势。肝脏的 染色图片也显示了随着苯甲酸钠蓄积，其对肝脏的损伤也逐渐加重。肝脏是新陈代谢的重要场所，其组织内易蓄积多种自由基，诱发氧化应激的发生 。为探讨肝脏组织损伤的分子机制，本研究对肝脏组织的氧化损伤程度和抗氧化能力进行了分析。是脂质过氧化作用的中间产物，氧自由基通过脂质过氧化作用可引起细胞损伤 。是机体重要的抗氧化酶之一，能够清除超氧阴离子自由基（），将其转化为 和，使细胞免受氧化损伤 。本研究发现，与生理盐水组比较，各苯甲酸钠处理组小鼠肝脏有 含量显著增高以及 活力显著下降的趋势，因此，推测受剂量和给毒时间的影响，肝脏细胞发生着不同程度的氧化应激反应。值得注意的是，本研究发现，与生理盐水组相比，苯甲酸钠处理组 周龄小鼠的 活力无显著差异，小鼠的肝脏系数也无显著差异，推测这与肝脏较强的再生和修复能力有关 。滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，细胞凋亡是机体为维护生长发育和抵抗外来病因干扰的程序性死亡。本研究显示，在不同的发育阶段，中、高剂量组小鼠肝组织的凋亡率显著增加，相关凋亡基因表达也发生了显著变化。细胞凋亡的诱发因素众多，活性氧含量增加导致氧化应激发生，是促使细胞发生凋亡的重要因素 。作为抑癌基因，在活性氧诱导的细胞凋亡中具有重要作用 。当细胞受到损伤时，活性氧诱导 表达上调 ，进一步调控 等基因转录。蛋白家族对细胞凋亡具有抑制作用，在胸腺细胞和淋巴细胞中可抑制 诱导的细胞凋亡 。蛋白主要分布在线粒体膜上 ，能够调控线粒体外膜的通透性。当 基因表达降低后，线粒体外膜通透性改变，释放 到细胞质中，激活下游信号 家族。是凋亡途径的终端执行者，当 被激活后，会切割细胞核内和细胞质中的结构蛋白和调节蛋白，最终诱导凋亡的发生 。结合肝脏中 和 检测结果，本研究推测，苯甲酸钠处理使得肝脏细胞发生了氧化损伤，并且诱发细胞启动 凋亡信号通路，激活 家族，促使细胞发生内源性凋亡。综上所述，长期摄入中、高剂量苯甲酸钠对青春期小鼠肝脏的发育造成了不可逆的氧化损伤，并诱发了 基因介导的线粒体途径的凋亡。参考文献 王思文，巩江，高昂，等 防腐剂苯甲酸钠的药理及毒理学研究 安徽农业科学，（）：胡明铅，王炯坤，蔡继业，等 应用原子力显微镜分析苯甲酸钠生物毒性 生物工程学报，（）：朱沁玲，余蓓，蒲玟静，等 食品防腐剂苯甲酸