MC3T3-E1细胞成骨模型的建立及局部黏着斑激酶表达的研究.pdf

基金项目：国家自然科学基金（，）；内蒙古自然科学基金（）；包头医学院 年研究生科研创新项目（）通讯作者：张春阳【基础医学】细胞成骨模型的建立及局部黏着斑激酶表达的研究曹志威，邵国，赵志军，张春阳，（内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 ；内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院神经外科；深圳市龙岗区第三人民医院转化医学中心；包头医学院神经外科疾病研究所；内蒙古自治区骨组织再生与损伤修复工程技术中心）摘要 目的：通过化学诱导手段建立 细胞成骨模型，探讨局部黏着斑激酶（）基因表达与成骨细胞形成的关系，了解 对成骨分化的影响。方法：观察 细胞成骨诱导前后细胞形态，茜素红化学染色检测矿化情况，实时荧光定量 检测成骨标志物 、的表达，同时分析 在成骨过程中的表达情况。结果：细胞成骨诱导 后细胞呈长梭形或多角形；第 、时，茜素红染色可见矿化结节；成骨标志物 、的表达呈持续升高的趋势，的表达总体呈升高趋势，在第 时略有下降。结论：的表达与成骨相关基因的表达趋势基本一致，提示 可能在 细胞成骨过程中发挥一定作用。关键词 细胞；成骨；局部黏着斑激酶 ：，（，；，；，；，；）：，：，年第 卷第 期 ，：；，：，；细胞（胚胎期小鼠颅顶处分离出的前骨细胞）是基础实验中最常用的成骨样细胞系之一，在体外可被当作一种理想模型来研究成骨细胞分化，通常应用于骨发育及修复等相关领域。研究者们在体外尝试使用不同配方的培养基来诱导其成骨 ，并通过添加或减少某种细胞因子、药物或生物材料来评估其对 细胞的成骨作用 。局部黏着斑激酶（，）是蛋白酪氨酸激酶超家族中的一员，在大部分哺乳动物中均有表达，并且能通过多种途径参与调节细胞的黏附、迁移、增殖分化等 。本课题前期实验证实，在大鼠颅骨发育过程中的表达是逐渐升高的，在第 周时达到最高值，然后趋于稳定，并且该趋势与大鼠颅骨发育规律基本一致。这提示 可能作为大鼠颅骨快速发育的生物标志物之一。在此，我们应用成骨分化培养基建立了 细胞成骨模型，并通过茜素红化学染色和成骨相关基因的表达情况鉴定了该模型。此外，确定了 在该细胞诱导成骨过程中的表达规律，这一结果为探索小儿颅骨生长发育过程中关键分子的变化，寻找小儿颅骨生长高峰期的生物标志物提供了实验依据。材料与方法 材料 细胞本实验选用 细胞（小鼠颅顶前骨细胞）购自武汉普诺赛生命科技有限公司（中国武汉，）。试剂 完全培养基（中国武汉普诺赛生命科技有限公司，）；胰蛋白 酶 （美 国 公 司，）；（美国 公司）；细胞成骨诱导分化培养基（含 的 完全培养液 地塞米松 甘油磷酸钠 抗坏血酸）、茜素红（）染料购自 中国赛业（广州）生物科技有限公司，；水（美国 公司，）；总 提取试剂 （美国 公司，）；异丙醇、无水乙醇（天津市永大化学试剂有限公司）；氯仿（北京化学工业试剂公司）；反转录试剂盒（美国 公司，）；引物委托上海生工公司合成；（中国北京康为世纪公司，）。方法 细胞成骨诱导 细胞在 培养箱中（设置温度 ，浓度为），使用含 胎牛血清、青霉素 钠盐和硫酸链霉素的 完全培养基培养。每隔 更换一次培养基。当细胞合并程度达 左右时，加入 胰蛋白酶 进行消化并传代。待细胞生长稳定后，将 细胞按 瓶接种到 的培养瓶中，每瓶加入 的 完全培养基，当细胞合并程度达 左右时，更换为 细胞成骨诱导分化培养基，前 内每 进行一次全量换液，后每隔 进行 次半量换液，直至 。整个培养过程中每隔 在显微镜下拍照并做好实验记录。茜素红化学染色 细胞以 孔的密度接种于六孔板中，每孔加入适量的 年第 卷第 期 完全培养基完全铺满孔板底部，然后将六孔板放在 培养箱中（设置温度为 ，浓度为）培养，每隔 全量换 次培养基，当细胞合并程度达 左右时，用 洗涤遍，往板中每孔加入 的 细胞成骨分化培养液，前 内每 全量换液次，在诱导 后每 半量换液一次，诱导分化 和 后，轻柔漂洗 次，往板中每孔加入 多聚甲醛室温固定 ，轻柔漂洗 遍，然后滴入 茜素红染料，室温静置 ，轻柔漂洗 次。显微镜下查看矿化结节的大小及分布情况。检测 及成骨相关基因表达将 细胞按 瓶接种到 的培养瓶中，每瓶加入 的 完全培养基，待细胞合并程度达 左右时，其中个培养瓶直接进行 提取，作为 对照组，其余组的细胞培养液更换为 细胞成骨诱导分化培养基，培养至 、时，分别进行 提取。使用总 提取试剂 提取细胞总 ，无酶水溶解后用 （，美国）测量 浓度，使用 反转录试剂盒将提取的 反转录为 。在罗氏 实时荧光定量 仪上使用 进行定量聚合酶链式反应。通过对照甘油醛 磷酸脱氢酶（）基因的归一化来确定相对基因表达水平作为内对照，并使用 方法进行定量。引物序列在表 列出。表 引物序列基因引物（；）：统计学分析通过 处理数据，应用 绘制统计图表，多样本均数两两比较使用单因素方差分析（）。表明差异有统计学意义。结果 细胞成骨诱导前后形态 细胞培养时已完全贴壁，生长状态较好，形状饱满，呈短梭形，胞体和细胞核较小。使用成骨分化诱导培养基培养 后细胞呈长梭形或多角形，胞体和细胞核变大，有多个树枝状突起（图 ）。图 细胞成骨诱导前后形态比较注：成骨前（）；：成骨第 （）茜素红染色对 细胞使用成骨分化诱导培养基培养数周后，用茜素红染料对其进行染色，结果出现了橘红色沉淀，显示出明显的钙化。并且随着诱导时间的延长，这种钙化程度越明显（图 ）。图 茜素红染色结果（橘红色部分为可见的矿化结节）注：成骨第 （）；：成骨第 （）；：定量测定 和成骨相关基因的表达在成骨诱导后的第、收集细胞（未诱导即第），检测 和 这两种成骨细胞标志物的 水平表达，并分析 基因的表达。随着诱导时间的延长，和 的表达呈持续升高的趋势，至 时达顶峰（图 ）。与 和 的表达类似，总体呈升高趋势，虽在第 时略有下降，但还是高于第 （图 ）。图 细胞成骨诱导后 及成骨相关基因 和 的表达注：与第 比较，年第 卷第 期 讨论 细胞在含抗坏血酸和地塞米松等诱导因子的成骨分化培养基中能够很好地向成骨细胞分化，模拟颅骨的生长过程。最新研究表明，可作为骨细胞内机械转导的感受器，通过感应流体剪切力（，）的变化，将机械信号转化为生物化学信号后传入细胞内，并参与骨细胞的增殖、分化、迁移等一系列生命活动 ，而在心肌细胞中 同样可作为压力感受器参与上述功能 。因此，本实验选择 细胞，在体外对其进行成骨诱导培养，通过茜素红化学染色和成骨相关基因的表达情况确定该模型的成功建立，并观察在 细胞成骨分化过程中 的表达情况，为颅骨生长发育的理论研究提供可能线索。本研究在对 细胞进行成骨诱导时，从以下 个方面鉴定了该模型。第一，从细胞形态上，发现未诱导时细胞呈短梭形，进行成骨诱导后细胞逐渐呈长梭形，并伸出多个树枝状突起，胞体和胞核逐渐变大，符合成骨细胞的形态 ；第二，经茜素红化学染色，显微镜下查看成骨分化第 和 的细胞，结果显示二者均有明显的矿化结节，并且第 的结节密度和面积大于第 ，矿化结节的出现是细胞成骨分化的标识之一 ；第三，成骨相关基因检测，是细胞成骨过程中的一种重要转录调节因子 ，它通过激活多种信号通路来调节细胞的增殖和分化 。有 种主要同工酶，其中组织非特异性碱性磷酸酶（）被发现与骨钙化有关，是成骨早期指标之一 。我们检测到二者在此模型中均持续增加，这与大多数文献描述一致 。在此基础上，我们检测了 的表达，其与成骨相关基因 、的 水平表达趋势几乎一致，这提示 或许在 细胞成骨过程中起着一定作用。在颅骨生长发育过程中，颅内压也不断变化，这提示二者可能存在某种潜在联系，基于本实验，我们猜测 很可能在颅骨细胞中作为压力感受器感受颅内压的变化进而调控颅骨的生长发育。在进一步的实验中，可以对 细胞施加一定的压力或通过转染等技术手段，来观察压力与 对成骨分化的影响，为进一步揭示 在颅骨生长发育中的具体作用机制提供新的线索。参考文献 ，（）：，（）：，（）：，（）：，：陈建明 调控 细胞成骨分化的作用机制研究 广州：南方医科大学，（）：曹志威，申杰，张司玺，等 对骨骼生长发育的影响 包头医学院学报，（）：，：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：）年第 卷第 期