不同种质地黄指纹图谱的建立及6种差异性成分的含量测定.pdf

地黄（Rehmannia glutinosa）是玄参科（Scrophulariaceae）地黄属多年生草本植物，以根茎入药，含有苯乙醇苷类1、环烯醚萜苷类2等物质，具有抗衰老、降血糖、抗肿瘤、调节免疫功能等多种药理作用3，故被广泛用于临床。近年来，虽有大量关于地黄中梓醇、地黄苷A、地黄苷D等指标性成分的含量测定4，以及熟地黄、酒地黄指纹图谱的研究5-6，但对地黄的研究也局限于同一产地甚至同一种质的差异性成分分析，目前仍缺乏整体综合评价不同种质地黄质量的方法。本研究通过对环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类等主要成分的定性分析和梓醇、地黄苷D、地黄苷A、益母草苷、毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷6种差异性成分的定量分析，为不同种质地黄的质量评价提供理论依据。1 实验部分1.1 仪器和试剂AL204万分之一电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；MS105DU十万分之一电子天平，奥豪斯仪器有限公司；HH-S2双孔智能水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司；10 L移液枪，艾本德国际贸易有限公司；Waters e2695高效液相色谱仪，美国沃特斯科技有限公司。红景天苷、松果菊苷、2-乙酰毛蕊花糖苷、梓醇、异类叶升麻苷对照品，纯度98.00%，成都曼思特生物科技有限公司；肉苁蓉苷A，纯度95.00%，成都德思特生物科技有限公司；地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷对照品，纯度98.00%，四川维克奇有限公司；益母草苷对照品，纯度98.00%，上海源叶生物科技有限公司；甲醇，分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；娃哈哈纯净水；蒸馏水。1.2 实验样品实验样品所用的85-5、BJ-1、QH-1、BX、金九、沁怀、山东7个种质地黄均来自于道地产区河南温县武德镇亢村怀地黄种植基地，整个生育期内统一管理，在地黄成熟期采收样品，随机选取10株长势一致的地黄植株，采集其块根。将地黄块根洗净后低温干燥，研细过50目筛，于干燥器中备用。表1样品信息样品编号S1S3S5S7种质信息85-5QH-1金九山东样品编号S2S4S6种质信息BJ-1BX沁怀2 方法与结果2.1 地黄块根HPLC指纹图谱方法的建立2.1.1 供试品溶液的制备精密称取样品粉末0.4 g，置于具塞锥形瓶中，精密移取甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放至室温，称定重量，补足失重，过滤，精密移取续滤液20 mL，置于蒸发皿中，65浓缩至干，20%色谱甲醇溶解定容至5 mL容量瓶中，摇匀，过0.22 m微孔滤膜，即得。收稿日期：2022-08-05基金项目：信阳农林学院校级教育教学改革研究与实践项目（2021XJGLX38）作者简介：耿晓桐（1995-），女，硕士研究生，助教，研究方向：中药质量控制，。不同种质地黄指纹图谱的建立及6种差异性成分的含量测定耿晓桐（信阳农林学院，河南 信阳 464000）摘要：目的:建立不同种质地黄高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并测定其中6种差异性成分的含量。方法:采用HPLC法建立7个种质地黄的指纹图谱并进行相似度评价，通过主成分分析、聚类分析、偏最小二乘法-判别分析对指纹图谱进行化学模式识别分析。对不同种质地黄中的6种差异性成分梓醇、地黄苷D、地黄苷A、益母草苷、毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷进行含量测定。结果:指纹图谱研究中地黄标定了15个共有峰，并指认出10个共有峰。聚类分析显示，BJ-1、BX与其他种质地黄存在显著差异。含量测定结果显示，各种质地黄梓醇含量较高，BJ-1地黄毛蕊花糖苷含量显著高于其他种质。结论:该研究建立的指纹图谱及含量测定方法能够快速、科学、准确地评价不同种质地黄的质量。关键词：地黄；高效液相色谱法；指纹图谱；含量测定；差异性成分doi：10.3969/j.issn.1008-553X.2023.02.030中图分类号：R28文献标识码：A文章编号：1008-553X（2023）02-0128-06安 徽 化 工ANHUI CHEMICAL INDUSTRYVol.49，No.2Apr.2023第49卷，第2期2023 年 4 月 分析测试 1282.1.2 对照品溶液的制备分别精密称取梓醇、地黄苷 A、地黄苷 D、益母草苷、红景天苷、松果菊苷、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷、2-乙酰毛蕊花糖苷对照品适量，用20%色谱甲醇溶解并定容至 5 mL 容量瓶中，即得各对照品溶液。2.1.3 色谱条件色谱柱：Diamonsil C18（4.6250 mm，5 m）；流动相：乙腈-0.1%醋酸水溶液梯度洗脱：05 min，3%A；520 min，3%5%A；2075 min，5%22%A；7590 min，22%28%A；9095 min，2829%A；进样量：20 L；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30。2.2 方法学考查2.2.1 精密度试验精密称取S1号样品地黄样品粉末0.4 g，按“2.1.1”项所示进行供试品溶液的制备，重复连续进样6次，记录各色谱图，并以10号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，各项RSD值均小于5%，表明仪器精密度良好。2.2.2 重复性试验精密称取S1号地黄药材粉末6份，并按“2.1.1”项所示进行供试品溶液的制备，分别进样记录各色谱图，并以10号峰为参照峰，记录各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，各项RSD 值均小于5%，表明试验重复性良好。2.2.3 稳定性试验精密称取S1号地黄药材粉末0.4 g，按“2.1.1”项所示进行供试品溶液的制备，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12h、24 h进样，记录色谱图，并以10号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，各项RSD值均小于5%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。2.3 地黄块根样品HPLC指纹叠加图谱及对照图谱的生成将7批地黄样品按“2.1.1”项所示进行供试品溶液的制备，按“2.1.3”项所示色谱条件操作，记录95 min色谱图，7批样品的特征图谱叠加图见图1，标准品图谱见图2。采用 中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）进行图谱拟合，设定时间窗宽度为0.5，选择S6为参照图谱，中位数法生成对照图谱，最终标定共有峰15个，见图3。2.4 相似度分析采用 中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A版），以对照指纹图谱的HPLC图谱为对照，进行整体相似度评价，见表2。以S6为参照图谱，设置时间窗宽度图1HPLC指纹图谱叠加图谱图3HPLC指纹图谱对照图谱1.梓醇；2.地黄苷D；3.地黄苷A；4.益母草苷；6.红景天苷；8.松果菊苷；9.肉苁蓉苷A；10.毛蕊花糖苷；12.异类叶升麻苷；13.2乙酰毛蕊花糖苷图2标准品图谱S1S2S3S4S5S6S7对照指纹图谱S110.9910.9900.8380.9930.9740.9870.992S20.99110.9950.8400.9970.9780.9920.998S30.9900.99510.8050.9970.9640.9860.997S40.8380.8400.80510.8260.9120.8810.842S50.9930.9970.9970.82610.9750.9910.999S60.9740.9780.9640.9120.97510.9920.981S70.9870.9920.9860.8810.9910.99210.995对照指纹图谱0.9920.9980.9970.8420.9990.9810.9951表2指纹图谱相似度耿晓桐：不同种质地黄指纹图谱的建立及6种差异性成分的含量测定129总第 242 期 2023 年第 2 期（第 49 卷）安 徽 化 工为0.5，使用参照谱多点校正并自动匹配，按中位数法生成对照图。结果表明，7批样品的相似度在0.8051，说明收集的不同品种地黄药材整体概貌有一定差异。2.5 地黄样品聚类分析将7批不同品种的地黄样品标定的15个共有峰面积导入SPSS 19.0软件，以欧式平方距离为测度，Z标准化，采用组间连接法进行聚类分析。在类间距为25时，7份样品被分为两类。BJ-1、BX（S2、S4）地黄样品首先聚为一类，其余地黄样品聚为另一类，具体见图4。图4地黄指纹图谱聚类树状关系2.6 主成分分析采用SPSS 19.0软件对7批地黄样品的15个共有峰峰面积原始数据进行标准化处理，以主成分贡献率及特征值为依据，进行主成分因子分析。本研究通过考查提取特征值、碎石图（主成分特征值的连续陡峭部分）、累积方差贡献率来确定最佳主成分数。由图5和表3可知，前5个主成分提取特征值较大（1），连线较陡峭，对解释变量的贡献最大，因而提取前5个主成分较为合适，其累积方差贡献率为97.953%，即选取5个主成分就涵盖了15个成分97.953%的信息量。通过正交旋转，得到15个指标在5个主成分中的旋转成分矩阵，见表4。根据旋转成分矩阵推测，影响不同种质地黄样品质量差异的成分不是单一成分，而是多成分协同作用的结果。由表4可知，第1主成分的信息主要来自峰2、3、4、9、10、12、13、15；第2主成分的信息主要来自峰1、4、5、6、7、8；第3主成分的信息主要来自色谱峰7、8、10、11；第4主成分的信息主要来自色谱峰5、11、14；第5主成分的信息主要来自色谱峰14。表3主成分解释率成分12345初始特征值5.6983.1402.7541.9081.193方差贡献率/%37.98720.93218.35812.7227.955累积贡献率/%37.98758.91877.27689.99897.953表4地黄样品成分矩阵峰号123456789101112131415成分10.1130.8330.755-0.701-0.185-0.2100.3440.1150.950-0.762-0.2210.943-0.680-0.160-0.90220.8820.401-0.2140.6400.6910.7110.5560.5380.1180.280-0.0080.220-0.1080.105-0.04030.4250.3110.472-0.165-0.1490.423-0.667-0.7170.1480.5820.5050.017-0.4100.4760.23440.098-0.0300.225-0.007-0.6050.443-0.1940.360-0.031-0.013-0.739-0.1770.3420.612-0.2205-0.079-0.0410.328-0.1190.214-0.2730.2880.1690.167-0.0530.3710.1120.4770.6010.2502.7 偏最小二乘法-判别分析由相似度和CA结果可知，BJ-1、BX与其他5个种质地黄存在明显差异，因此选择偏最小二乘法-判别分析（Partial Least Squares-Discriminant Analysis，PLS-DA）对7个种质地黄进行种质差异性成分表征7。将 7 批不同种质地黄的 15 个共有峰峰面积导入SIMCA-P14.1软件进行PLS-DA分析，结果显示，自变量累积解释能力参数（R2X）为0.998，因变量累积解释能力参数（R2Y）为0.868，预测能力参数（Q2）为0.645，均大于0.5，表明该模型拟合效果较好。以变量投影重要性（Variable Importance in the Projection，VIP）值1为标图5公共因子碎石图130准，筛选质量差异标志物，结果共得到5个差异性成分，依次为毛蕊花糖苷（峰10）、地黄苷A（峰3）、地黄苷D（峰2）、益母草苷（峰4）、梓醇（峰1）、异类叶升麻苷（峰12），见图4。图4不同种质地黄PLS-DA图和VIP图2.8 环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类等6种成分的含量测定2.8.1 6种成分对照品贮备液的制备分别取梓醇、地黄苷D、地黄苷A、益母草苷、毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷对照品 5.79 mg、3.99 mg、5.98mg、5.16 mg、6.92 mg、1.89 mg，精密称定，用