白术叶片DNA提取方法的优化.pdf

白术叶片 DNA 提取方法的优化蒋小刚,王 华,周武先,由金文,张美德(湖北省农业科学院中药材研究所农业农村部中药材生物学与栽培重点实验室,湖北恩施 445000)摘要 目的优化白术叶片 DNA 提取方法,提取高质量DNA,用于分子生物学研究。方法以白术叶片为材料,比较常规 CTAB 法、改良 CTAB 法、SDS 法、试剂盒法提取 DNA 的效果,并对改良 CTAB 法中的裂解温度、裂解时间、核分离液解离次数进行优化,用琼脂糖凝胶电泳和微量核酸测定仪检测 DNA 的浓度和纯度。最后通过 ISSR-PCR 验证优化的改良 CTAB 法提取 DNA 的效果。结果4 种方法中,改良 CTAB 法提取白术叶片 DNA 效果最好。针对叶片的改良 CTAB 法的优化条件为裂解温度 65、裂解时间 20 min、解离次数 2 次;ISSR-PCR 验证结果表明扩增条带清晰稳定,无拖尾。结论优化后的改良 CTAB 法提取白术叶片 DNA 质量高,可用于白术种质资源遗传多样性分析。关键词 白术;DNA;提取方法;改良 CTAB 法中图分类号 R284 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2023)11-0128-04doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2023.11.032 开放科学(资源服务)标识码(OSID):Optimization of DNA Extraction Method for Atractylodes macrocephala LeavesJIANG Xiao-gang,WANG Hua,ZHOU Wu-xian et al(Key Laboratory of Biology and Cultivation of Herb Medicine,Ministry of Agricul-ture and Rural Affairs,Institute of Chinese Herbal Medicines,Hubei Academy of Agricultural Sciences,Enshi,Hubei 445000)Abstract ObjectiveTo optimize the DNA extraction method of Atractylodes macrocephala leaves and extract high-quality DNA for molecular biology research.MethodA.macrocephala leaves were used as material,the DNA extraction effects of four methods(conventional CTAB,modified CTAB,SDS and Kit method)were compared,and the cracking temperature,cracking time and times of nuclear separation liquid ex-traction in the modified CTAB method were optimized,the concentration and purity of the extracted DNA were detected by agarose gel electro-phoresis and spectrophotometer.Finally,the effects of DNA extracted by the modified CTAB method after optimization was verified by ISSR analysis.ResultAmong the four extraction methods,the modified CTAB method had the best extraction effects of DNA.The optimal extraction conditions of the improved CTAB method of leaves were as follows:cracking temperature was 65,cracking time was twenty minutes,dissocia-tion times was twice.The ISSR-PCR validation results showed that the amplified bands were clear and stable,without any trailing.ConclusionThe optimized CTAB method was effective in extracting DNA of A.macrocephala leaves.And it could be used for genetic diversity analysis of A.macrocephala.Key words Atractylodes macrocephala;DNA;Extraction method;Modified CTAB method基金项目现代农业产业技术体系建设专项(CARS-21);湖北省农业科技创新中心 2020 年重大科技研发项目(2020-620-000-002-04);湖北省重点研发计划项目(2020BCA059);湖北省农业科学院青年科学基金项目(2021NKYJJ19)。作者简介 蒋小刚(1991),男,湖北黄冈人,助理研究员,硕士,从事药用植物栽培与育种研究。通信作者,研究员,博士,从事药用植物栽培与育种研究。收稿日期 2022-07-08;修回日期 2022-08-12 白术(Atractylodes macrocephala Koidz.)属于菊科苍术属多年生草本植物,以根茎入药,具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎的功效1。基于分子生物学技术开展药用植物种质资源评价工作尤为重要,而高效提取 DNA 是更好进行分子生物学研究的前提,此外,大多数药用植物组织中富含多糖、多酚等物质,常规方法提取的 DNA 较难满足 PCR、基因克隆、测序等分子生物学需求,因此很多学者开展了药用植物基因组 DNA 提取方法的优化研究,以建立高效提取高质量 DNA 的方法。邵亚林等2以杏黄兜兰叶片为材料,比较了 CTAB 法、改良 CTAB 法、高盐低 pH 法和 SDS 法提取 DNA 的效果,结果表明,改良 CTAB 法优于其他方法,但提取的 DNA 存在一定蛋白质污染,且未进行 PCR 扩增反应验证。郑斯斯等3以壳斗科植物叶片为材料,比较不同方法提取 DNA 效果并对最佳方法进行优化,结果表明,优化后的改良 CTAB 法提取 DNA 浓度和纯度高,适用于 PCR 扩增和酶切反应。针对不同药用植物或药用植物的不同组织,需建立相适应的 DNA提取方法,而有关白术不同组织基因组 DNA 提取方法的研究较少,多采用 CTAB 法。如黄恒等4对改良 CTAB 法和SDS 法提取白术叶片基因组 DNA 的效果进行比较,结果表明,改良 CTAB 法提取白术叶片 DNA 质量高于 SDS 法,可作为模板用于分子标记研究,但提取 DNA 用时较长;王志安等5采用 CTAB 法提取白术幼嫩叶片的基因组 DNA,并构建了 DNA 指纹图谱,结果表明,提取的白术基因组 DNA 适用于 AFLP 指纹图谱分析,但存在一定量蛋白质、多酚等物质污染;曹亮等6采用改良 CTAB 法提取白术、苍术的干种子DNA,并通过多重 PCR 技术对白术、苍术混杂种子进行鉴别,结果表明,提取的 DNA 模板满足于多重 PCR 反应,但提取 DNA 所需时间较长。也有研究采用试剂盒法提取白术DNA,如余亚东等7采用试剂盒法提取白术、苍术根茎 DNA,并建立了鉴别白术、苍术等的 DNA 条形码技术,结果表明,提取的 DNA 模板适用于 PCR 扩增及进一步的种质鉴定研究,但 DNA 提取量较低,且成本高。以上研究,以白术为研究对象,主要采用改良 CTAB 法提取基因组 DNA,基本能满足分子生物学的研究,但存在用时较长、DNA 质量偏低的问题,虽然试剂盒法能有效去除 DNA 中的多糖多酚物质,但成本较高、提取 DNA 量较少,同时伴随一定降解3。该研究以白术幼嫩叶片为材料,比较常规 CTAB 法、改良 CTAB 法、SDS 法、试剂盒法提取 DNA 的效果,并对改良 CTAB 法中的 安徽农业科学,J.Anhui Agric.Sci.2023,51(11):128-131裂解温度、裂解时间、解离次数等因素进行优化,然后用琼脂糖凝胶电泳和超微量核酸检测仪检测 DNA 浓度和纯度,最后通过 ISSR-PCR 验证优化的改良 CTAB 法提取 DNA 的效果,以便用于白术遗传多样性分析、种质鉴定等研究。1 材料与方法1.1 试验材料 供试材料包括一年生白术幼嫩叶片。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)、核糖核酸 A(RNaseA)、氯仿、异戊醇、异丙醇、DL2000 DNA Marker、琼脂糖,均购自武汉中恩科技有限公司。主要仪器设备包括离心机(SIGMA 3K15)、电泳仪(DYCP-31DN)、超微量核酸蛋白测定仪(Thermo NANODROP ONE)、PCR 仪(DYY-12)。1.2 试验方法 1.2.1不同 DNA 提取方法。采用常规 CTAB 法、改良CTAB 法、SDS 法和试剂盒法提取白术叶片基因组 DNA。1.2.1.1常规 CTAB 法。参照马辉等8的方法并进行改进,具体步骤如下:取 0.2 g 白术幼嫩叶片于预冷研钵中,液氮中迅速研磨后转入 2 mL 离心管中,加入 800 L CTAB 核裂解液(100 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0;50 mmol/L EDTA,pH 8.0;1.4 mol/L NaCl;2%CTAB;2%PVP;2%-巯基乙醇)和20 mg/mL 蛋白酶 K 5 L,65 水浴40 min(期间每隔10 min轻轻摇动离心管一次),然后加入等体积的氯仿-异戊醇(241),混匀 30 min,12 000 r/min 离心 15 min,取上清液至 2 mL离心管中,然后加入等体积的预冷异丙醇,混匀,12 000 r/min离心 15 min,弃上清。用 95%乙醇清洗沉淀 2 次,室温风干,加 50 L TE 缓冲液溶解沉淀,加 5 L RNaseA(10 mg/mL)混匀,室温放置 30 min,-20 保存备用。1.2.1.2 改良 CTAB 法。取 0.2 g 白术幼嫩叶片于预冷研钵中,液氮中迅速研磨后转入 2 mL 离心管中,加入 1.5 mL 4 预冷的核分离液混匀,12 000 r/min 离心 10 min,弃上清收集沉淀,将上述收集沉淀按常规 CTAB 法提取。1.2.1.3SDS 法。参照王景雪等9的方法稍作改动,具体步骤如下:取 0.2 g 白术幼嫩叶片于预冷研钵中,液氮中迅速研 磨 后 转 入 2 mL 离 心 管 中,加 入 800 L 溶 液 I(500 mmol/L NaCl;50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0;50 mmol/L EDTA;2%PVP;2%-巯基乙醇),置于室温数分钟至解冻;加入 280 L 10%SDS,轻轻混匀,4565 水浴 2040 min(期间每隔 10 min 轻轻摇动离心管一次);取出后立即置于冰上,并加入 120 L 5 mol/L 醋酸钾于冰上反应 30 min,在 12 000 r/min、4 下离心20 min;取上清液,加入等体积异丙醇,轻轻混匀后,-20 放置 1 h,于 4 下离心 20 min