SPARCL1基因多态性与动脉粥样硬化遗传易感相关性分析.pdf

872安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)网络出版时间：2023-04-21 10：22：02 网络出版地址:h t t ps:/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1342.028.h t mlSPARCL1基因多态性与动脉粥样硬化遗传易感相关性分析陈心严，程 煦駕陈婷婷彳,王 华，张 敏1,朱华庆笃程筱雯I摘要目的探讨富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白类似蛋白 1(SP ARCL1)的单核昔酸多态性(SNP)位点r s7695558、r sl 049539与动脉粥样硬化(AS)的遗传易感相关性。方法采用病例对照研究，选取209例AS患者作为病例组，年 龄、性别相匹配的208例健康体检者作为对照组。利用酶联 免疫吸附试验(ELISA)测定血清SP ARCL1表达水平，使用 线性和Lo g ist ic回归分析评估SP ARCL1水平和血管危险因 素、生活方式、人口统计学变量之间的相关性。通过免疫组 织化学实验评估发生粥样硬化病变的动脉组织和相对正常 动脉组织中的SP ARCL1蛋白的表达水平及定位，随后用高 分辨率熔解曲线法对51例AS患者和50例健康对照者 DNA 的 SP ARCL1 基因的两个 SNP 位点 r s7695558(A/G)、r sl O49539(T/C)进行基因分型，使用P ea r so n X2检验分别分 析r s7695558、r sl 049539多态性与AS患者易感性之间的关 系。结果 AS患者的SP ARCL1血清表达水平低于对照组(Z=-2.916,P=0.004)o SP ARCL1 水平与患者年龄(P=0.027)、舒张压(P=0.008)有关，而与患者的性别及部分心 血管危险因素无明显相关(P 0.05)。冠状动脉组织中粥 样硬化病变部位的SP ARCL1表达水平增高。r s7695558和 r sl 049539在病例组和对照组间的基因分布差异无统计学意 义(P 0.05)。r s7695558的隐性遗传模型中，含A和不含A 的基因分布有差异，不含A等位基因(GG)的患者比含A等 位基因(AA+AG)的患者的AS发病风险低,OR值为0.417,95%CI-0.184 0.945,在10%的置信水平上显著(P=0.034)。结论首次在中国安徽人群中鉴定了位于人类 SP ARCL1基因内含子内的与AS风险相关的新易感位点 r s7695558,同时提示SP ARCL1可能作为血管保护因子发挥 抗AS作用。关键词动脉粥样硬化;SP ARCL1;基因多态性;遗传易感性 中图分类号 R 543.5文献标志码A 文章编号1000-1492(2023)05-0872-05 d o i:10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.0292022-12-10 接收基金项目：国家自然科学基金(编号:82170484)作者单位:安徽医科大学第一附属医院检验科、2心脏外科、肿瘤科，合肥 230022安徽医科大学彳病理教研室、炎症免疫性疾病安徽省实 验室、生化与分子生物学教研室，合肥230032作者简介:陈心严，女，硕士研究生；程筱雯，女,副教授，硕士生导师，责任作者,E-ma il:w in d-y l 35 sin a.c o m全球疾病负担报告显示，由动脉粥样硬化(a t h er o sc l er o sis,AS)引起的心脑血管疾病是现代社 会威胁人类健康的首要原因。AS的发生原因较复 杂，包括环境和遗传因素等2-4o单核昔酸多态性(sin g l e n u c l eo t id e po l y mo r ph ism,SNP)构成 90%以上 人类基因组遗传变异，目前已发现很多与AS有关 联的易感基因位点。富含半胱氨酸的酸性分泌 蛋白类似蛋白 1(sec r et ed pr o t ein a c id ic a n d r ic h in c y st ein e-l ik e 1,SP ARCL1)是一种胞外基质蛋白，具 有抗黏附、参与细胞增殖和迁移的功能。相同的 组织中,SP ARCL1在疾病状况下表达有所变化。SP ARCL1在前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结直 肠癌等多种癌症中表达下调，认为SP ARCL1可能有 抑癌作用7_10o目前尚未见SP ARCL1与AS关系 的文献报道，也鲜有关于SP ARCL1基因多态性的研 究。该研究拟通过病例对照研究，分析SP ARCL1在 AS患者和健康对照者中的表达情况及SP ARCL1的 SNP 位点(r s7695558 和 r sl 049539)与 AS 的相关 性，探讨SP ARCL1在AS发生发展过程中的可能作 用，为AS的诊疗研究提供新的思路。1材料与方法1.1病例资料选取安徽医科大学第一附属医院 2019年12月一2020年6月收治的209例AS患者 为研究对象，同一时期的208例健康体检者为对照 组。随机选择其中51例AS患者和年龄性别相匹 配的50例健康体检者的全血用于提取DNAO后续 免疫组化实验所用冠状动脉组织源自安徽医科大学 第一附属医院病理中心的临床解剖组织标本(10 例)。所有AS的诊断均经临床确立。对照组经临 床检査排除心脑血管疾病,且肝肾功能正常,与病例 组年龄、性别相匹配。本研究所选取的研究对象与 健康体检者均来自安徽省。1.2方法1.2.1标本采集与DNA提取 采集空腹静脉血,全血用于提取DNA,促凝血离心分离后收集的血清 用于酶联免疫吸附试验(en zy me l in k ed immu n o so rben t a ssa y,ELISA)0严格按照试剂盒的说明书，从 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)873全血标本中提取基因组DNAO使用Na n o Dr o p o n e(美国Th er mo公司)检测DNA含量，样品DNA的 A260/A280在1.8-2.0之间时，认为已达到所要求 的纯度。1.2.2 EUSA试验 严格按照人SP ARCL1酶联免 疫分析试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)的说 明书操作。酶标板设置标准品孔、样本孔、空白孔(样本孔设置3个复孔)，经加样、加酶、温育、洗涤、显色、终止、测定等步骤后,用酶标仪读取各孔吸光 度值，计算样品浓度。1.2.3免疫组织化学3厚的石蜡组织切片经 65咒烤片2 h后脱蜡水化,并在柠檬酸钠缓冲液(10 mmo l/L,pH 6.0)中微波加热以修复抗原。然 后加入适量内源性过氧化物酶阻断剂室温阻断10 min,用P BS缓冲液冲洗3 min x 3次,然后将切片与 多克隆抗SP ARCL1抗体(pr o t ein t ec h,武汉三鹰生物 技术有限公司)以1:200的稀释度在37七温箱孵 育1 h,P BS缓冲液冲洗3 min x 3次,再滴加酶标羊 抗小鼠/兔Ig G聚合物室温孵育20 min,P BS缓冲液 冲洗3 min x 3次,最后进行显色反应。1.2.4 SNP基因分型 在Lig h t Cy c l ei480荧光定量 P CR仪上通过高分辨率熔解曲线分析(h ig h r eso l ut io n mel t in g,HRM)对样本进行基因分型。P CR在 96孔板中以20 pel的体积进行，包括10 150 n g的 DNA,2 mmo l/L 的每种引物,2.5 mmo l/L 的 Mg Cl?,水和Lig h t Cy c l er 480高分辨率熔解预混液。按照以 下反应条件进行:95 X.10 min；95 C 30 s,45个循 环;58 C 30 s；72 C 30 s。通过在 70 97 弋以每 1 C 25次采集的速率获得HRM曲线数据。AA和TT 表示野生纯合基因型,AG和TC表示杂合突变基因 型,GG和CC表示纯合突变基因型。1.3统计学处理 采用SP SS 26.0统计软件进行 数据分析。正态分布定量资料以 s描述，比较采 用t检验;偏态分布数据以M(P25,厲5)描述，比较采 用Ma n n-Wh it n ey U检验;定性资料采用频率描述,比较采用X2检验。P 0.05)；但AS患者的SP ARCL1血清表达水平低对照组(Z=-2.916,P=0.004)。见表 1。表1 SPARCL1在病例组和对照组中血清表达水平指标病例组(n=209)对照组5 二 208)X%值P值性别(%)0.0010.971男134(64.11)133(63.94)女75(35.89)75(36.06)年龄岁，Gs)57.69 5.4057.76 5.41-0.1330.894SP ARCL1 n g/ml,422.18(389.48,442.18(383.97,-2.9160.004M(P 2575)453.49)499.56)2.2 SPARCL1血清水平和AS发病风险关联的分 层分析 从以上AS病例人群中筛选出有AS发病 风险因素数据的人群，420 n g/ml为该组人群 SP ARCL1血清水平的中位数，以420 n g/ml为分组 切点，比较两组研究对象的年龄、性别、心血管危险 因素等指标，结果显示SP ARCL1水平与患者年龄(P=0.027)、舒张压有关(P=0.008),与 SP ARCL1 血清水平低的患者比较,SP ARCL1水平高的患者年 龄更高且舒张压更低。见表2。表2 2 SPARCL1不同水平和AS发病风险因素的组间比较指标SP ARCLl 水平X2/Z 值p值0.05)。见表3。3讨论AS是一种脂质驱动的慢性炎症性疾病，其发病 原因复杂,包括遗传及环境因素n,SNP作为第3 代遗传标记广泛存在于各类物种中,成为个体差异 化和疾病发生发展的基础。SP ARCL1基因位于人 类染色体4q 22 25,该基因包括11个外显子和10 个内含子12,包含多个$池$,其中r s7695558为内 含子突变，r sl 049539为外显子突变。先前有研 究问报道r s7695558与阿尔兹海默患者脑中 SP ARCL1低表达有关，表明SP ARCL1在神经炎症 表3 两组SPARCL1基因SNP位点 曲695558(A/G)和rsl049539(T/C)基因型分布情况遗传模型病例组(%)对照组n(%)JOR 值(95%C7)值P值共显性AA9(17.65)5(10.00)1.0004.6760.097AG27(52.94)20(40.00)0.750(0.218-2.583)0.2090.648GG15(29.41)25(50.00)0.333(0.094 1.183)3.0130.083TT24(47.06)26(52.00)1.0000.4350.848TC24(47.06)22(44.00)1.182(0.530-2.634)0.1670.683CC3(5.88)2(4.00)1.625(0.250-10.578)0.2620.669隐性AA+AG36(70.59)25(50.00)1.000GG15(29.41)25(50.00)0.417(0.184-0.945)4.4740.034TT+TC48(94.12)48(96.00)1.000CC3(5.88)2(4.00)1.500(0.24-9.382)0.05)Th e ex pr essio n l ev el o f SP ARCL1 in a t h er o sc l er o t ic l esio n s o f c o r o n a r y a rt er y t issu e in c r ea sed Th er e w a s n o sig n if ic a n t d if f er en c e in