BMP2-PLGA_Doxy-PLGA纳米微球联合CS_β-GP复合温敏水凝胶的制备及性质检测.pdf

北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023，Vol.31，No.288牙周炎会导致牙槽骨吸收、牙齿松动直至脱落1。如何促进炎症环境下牙槽骨再生 2，是牙周炎治疗的难点。目前用材料携带生长因子是再生研究的主要方向之一，但如何延长生长因子的作用，是其在临床起作用的关键。因此缓释系统被引入再生研究，生长因子与载体结合后能在合适位置长期释放并保持活性3。骨再生研究中骨形成蛋白 2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）诱导骨形成能力强，被广泛应用4。因为炎症的存在，促成骨的同时可考虑应用抗炎药物，四环素族抗炎功能强，骨定向性好，可以减轻牙周组织破坏5，其中多西环BMP2-PLGA/Doxy-PLGA纳米微球联合CS/-GP复合温敏水凝胶的制备及性质检测邓易君 杨森 赵芳玮 胡颖 董蕊【摘要】目的 制备 BMP2-PLGA/Doxy-PLGA 纳米微球混合 CS/-GP 复合温敏水凝胶，并检测其性质。方法 复乳法分别制备 BMP2-PLGA、Doxy-PLGA 纳米微球，通过扫描电镜、粒度仪、重量变化测定其表征、粒径、降解率。交联法制备 CS/-GP 温敏水凝胶，通过倒置法、重量变化测定凝胶时间及降解率。所获的纳米微球与水凝胶混合获得复合水凝胶，分 8 组：BMP2-PLGA 与 Doxy-PLGA 比例各为 3:1、2:1、1:1、1:2、1:3 的复合水凝胶、BMP2-PLGA 水凝胶、Doxy-PLGA 水凝胶、PLGA 水凝胶。Elisa 和紫外分光法测定释药曲线。各组分别与MC3T3 细胞共培养后 CCK8 法检测细胞毒性。TNF-营造炎性环境，正常营养环境与炎性环境下与 MC3T3 细胞共培养后，qRT-PCR 检测成骨基因 ALP 和 OCN 的表达。结果 空白 PLGA、BMP2-PLGA、Doxy-PLGA 均无细胞毒性，平均粒径无统计学差异。BMP2-PLGA/Doxy-PLGA 复合水凝胶 37 下 4 min 内形成凝胶，体外缓释BMP2 达 49 天、Doxy 达 56 天，无细胞毒性。炎性及非炎性环境下与 MC3T3 细胞共培养 1 天后，BMP2-PLGA 与Doxy-PLGA 比例为 1:1 的复合水凝胶组细胞 ALP、OCN 表达水平相比对照组明显增加，其余各组间无统计学差异，共培养 3、7 天后，各组表达水平相比对照组都明显增加，其中 BMP2-PLGA 与 Doxy-PLGA 比例为 1:1 的复合水凝胶组的表达水平最高，具有统计学差异。结论 BMP2-PLGA/Doxy-PLGA 混合 CS/-GP 水凝胶可以获得无细胞毒性缓释效果好的复合温敏水凝胶，该材料可以显著促进炎性环境下细胞的体外成骨分化。【关键词】BMP2；多西环素；缓释；成骨分化【中图号】R783.1【文献标识码】A【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2023.02.003Preparation and property of CS/-GP composite thermosensitive hydrogel mixed with BMP2-PLGA/doxycycline-PLGA nano-microsphere DENG Yi-jun,YANG Sen,ZHAO Fang-wei,HU Ying,DONG Rui.Beijing Institute of Dental Research,Capital Medical University School of Stomatology,Beijing 100050,China【Abstract】Objective To prepare CS/-GP composite thermosensitive hydrogel mixed with BMP2-PLGA/Doxy-PLGA nano-microsphere and test their properties.Methods BMP2-PLGA and Doxy-PLGA nano-microsphere were prepared by double emulsification technology.The surface morphology,particle size of nano-microsphere were determined by SEM and particle size analyzer.CS/-GP thermosensitive hydrogel was prepared by physical cross-linking method.Then nano-microsphere and CS/-GP thermosensitive hydrogel were mixed to obtain composite hydrogel.Then release curve of hydrogel was measured by Elisa and UV spectrophotometry.After co-cultured with MC3T3 cells in vitro,the cytotoxicity was detected by CCK8.After co-cultured with MC3T3 cells in non-inflammatory environment and inflammatory environment,the expression of osteogenesis genes ALP and OCN was examined by qRT-PCR.Results The blank PLGA,BMP2-PLGA,Doxy-PLGA had no cytotoxicity.CS/-GP thermosensitive hydrogel mixed with BMP2-PLGA/Doxy-PLGA formed gel within 4 min at 37.After MC3T3 cells were co-cultured with BMP2-PLGA/Doxy-PLGA composite hydrogel for 1 day in non-inflammatory and inflammatory environments,ALP and OCN expression in 1:1 mixed group cells increased compared with the control group.Conclusions BMP2-PLGA/Doxy-PLGA hybrid CS/-GP hydrogel can obtain a compound thermosensitive hydrogel with cytotoxic free and slow release effect.The composite hydrogel with BMP2-PLGA/Doxy-PLGA ratio of 1:1 can significantly promote the osteoblastic differentiation of cells in inflammatory environment in vitro.【Key words】BMP2；Doxycycline；Sustained release；Osteogenic differentiation 基金项目：2019 年北京市东城区优秀人才作者单位：100050 北京 首都医科大学口腔医学院口腔医学研究所（邓易君、杨森、赵芳玮、胡颖），教育处（董蕊）通信作者：董蕊，E-mail：，电话：010-57099324北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023，Vol.31，No.289素（Doxycycline，Doxy）抗炎功能强于四环素，对成骨细胞无毒6。因此将 BMP2 及 Doxy 联合应用使其缓慢释放则需要合适的缓释系统。目前聚乳酸-乙醇酸共聚物 poly（D,L-lactide-co-glycolide），PLGA 是常用的缓释材料7,但研究发现 PLGA 微球在前 48 h 释放超过 19的药物后再进入缓释阶段8，造成浪费，即突释效应，壳聚糖（chitosan，CS）/-甘油磷酸钠（-glycerophosphate，-GP）温敏水凝胶免疫原性低，可在 37下迅速形成凝胶，便于操作9。如将 CS/-GP 水凝胶复合PLGA 微球后可以减少突释，便于给药10。因此，本研究先构建 Doxy-PLGA、BMP2-PLGA纳米微球，再将其与 CS/-GP 水凝胶联合应用制备复合温敏水凝胶，对其性质及体外促成骨分化作用进行检测，为进一步体内实验提供依据。材料和方法1.主要仪器与试剂Doxy（Bioruler，美国）；PLGA（Sigma，美国）；CS（展云，中国）；-GP（Innochem，中国）；BMP2，BMP2Elisa 试剂盒，CCK8 试剂盒（Abcolonal，中国）；RNA 提取试剂盒，逆转录试剂盒（CWbio，中国）。紫外测量仪（Thermo，美国）；超声破碎仪（之信，中国）；扫描电镜（Hitachi，日本）；粒度分析仪（NanoBrook，美国）；荧光定量 PCR 仪（BioRad，美国）；酶标仪（Spectramax，美国）。2.纳米微球制备及检测纳米微球制备：BMP2-PLGA：1 g BMP2 溶于50 l DPBS，加入 0.5 ml 100 mg/ml PLGA 的 CH2Cl2溶液中，冰浴下超声破碎仪 60 W 脉冲超声 30 次获得初乳液，将其加入 5 ml 2聚乙烯醇水溶液，冰浴下 80 W 脉冲超声 60 次获得复乳液后置于通风橱内 800 r/min 磁力搅拌 8 h。收集混悬液 10000 r/min 离心 15 min，ddH2O 洗 2 次，混匀，60 W 超声 45 次分散。所得悬浮液-80过夜后冻干，即获得 BMP2-PLGA 纳米微球。Doxy-PLGA：5 mg Doxy 溶于 50 l DPBS，其余步骤同 BMP2-PLGA 制备。包封率测定：ELISA 和紫外分光法测定离心后上清中未包封 BMP2、Doxy 的含量，计算包封率。性质检测:分 3 组：PLGA、BMP2-PLGA、Doxy-PLGA，每组 3 个样本。分别稀释为 1 mg/ml 混悬液滴到硅片上室温晾干后喷金，扫描电子显微镜观察表面形貌；粒径分析仪分别测定粒径；将 1 ml 20 mg/ml 的 3 组微球 PBS 溶液 37恒温孵育，每周冻干称重，检测 8 w，计算未降解比例。3.CS/-GP 水凝胶、复合水凝胶的制备及检测水凝胶制备:CS 高压蒸汽灭菌，0.1 mol/L 乙酸配置 0.022 g/ml CS 溶液。配置 0.56 g/ml-GP 水溶液，过滤除菌；-GP 溶液以 1:3 体积比加入CS 溶液,冰浴搅拌 15 min，调 pH 到 7.4。性质检测:分 10 组：Doxy 水凝胶（5 mg/ml）、BMP2 水凝胶（1g/ml）、8 组微球水凝胶（20 mg/ml）：PLGA 水凝胶、BMP2-PLGA 水凝胶、Doxy-PLGA 水凝胶、BMP2-PLGA 与 Doxy-PLGA 比例各为 3:1、2:1、1:1、1:2、1:3 的复合水凝胶，每组 3个样本。各取 0.5 ml 加入 Ep 管中 37水浴，观察管内溶液是否流动，至不流动记为凝胶形成时间。各组取 0.5 ml 37下形成凝胶后加入 1 ml PBS，37孵育，每周全部冻干称重后，重新加入 1 ml PBS 37孵育，检测 8 w，计算未降解比例。4.纳米微球及复合水凝胶的体