miR-495通过抑制RNF113A的表达调控食管鳞癌细胞恶性表型.pdf

2 0 2CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS论著癌变畸变突变Vol.35No.3May 2023miR-495通过抑制RNF113A的表达调控食管鳞癌细胞恶性表型付静，刘清，于海叶，王磊*(新疆医科大学第一附属医院消化内科，新疆乌鲁木齐830011)Regulation of malignant phenotypeof esophageal squamouscarcinoma cells by miR-495via suppressing the expressionof RNF113AFU Jing,LIU Qing,YU Haiye,WANG Lei*(Department of Gastroenterology,The First Affiliated Hospital of XinjiangMedical University,Urumqi 830011,Xinjiang,China)收稿日期：2022-10-28；修订日期：2022-12-22基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金青年科学基金(2016D01C320)作者信息：付静，E-mail：。*通信作者，王磊，E-mail：【摘要】目的：探讨微小RNA-495(miR-495)对食管鳞癌细胞恶性表型的影响及分子机制。方法：在食管鳞癌细胞Eca109中转染miR-495模拟物、miR-495抑制剂及相应的随机对照序列，分别采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测miR-495的表达，CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞周期及凋亡率变化，Transwell 实验检测细胞的侵袭和迁移情况，并用 qPCR 和Western blot检测下游靶基因RNF113A mRNA和蛋白的表达。结果：与对照组比较，转染miR-495模拟物组Eca109细胞中miR-495 mRNA水平显著升高(P0.05)，转染miR-495抑制剂组Eca109细胞中miR-495 mRNA水平显著降低(P0.05)；与对照组比较，转染miR-495模拟物组细胞凋亡增多(P0.01)，迁移和侵袭能力下降(P0.01)，细胞被阻滞在G0/G1期(P0.01)；转染miR-495抑制剂组细胞凋亡减少(P0.01)，迁移和侵袭能力升高(P0.01)，进入细胞周期S期的细胞显著增多(P0.05)。与对照组比较，转染miR-495模拟物组Eca109细胞中RNF113A蛋白水平表达下调(P0.05)，转染miR-495抑制剂组RNF113A蛋白水平表达上调(P0.05)。结论：miR-495可促进Eca109细胞凋亡，抑制其迁移和侵袭能力，并调控细胞周期分布，miR-495可能通过调控RNF113A蛋白表达介导食管鳞癌细胞的恶性表型变化。【关键词】食管鳞癌；miR-495；RNF113A；恶性表型中图分类号：R735.1文献标志码：A文章编号：1004-616X(2023)03-0202-08doi：10.3969/j.issn.1004-616x.2023.03.008【ABSTRACT】OBJECTIVE：To explore effects of microRNA-495(miR-495)on malignant phenotype ofesophageal squamous carcinoma cells and its molecular mechanisms.METHODS：miR-495 mimics and miR-495 inhibitors，and the corresponding random sequence control were transfected into esophageal cancer cellsEca109.Real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreactionPCR(qPCR)wasusedtodetectexpression of miR-495，CCK-8 to detect cell proliferation，flow cytometry to detect cell cycle and apoptosis，transwell to detect cell migration and invasion ability，qPCR and western blot to detect expression of mRNAsand proteins of downstream target gene RNF113A.RESULTS：Compared with the control group，the miR-495mRNA levels in the miR-495 mimics transfected group were significantly increased(P0.05)，and in themiR-495 inhibitor transfected group was significantly decreased(P0.05).ThemigrationandinvasionnumbersinthemiR-495mimicstransfectedgroupweresignificantlydecreased(P0.01)，andtheapoptosisratewassignificantlyincreased(P0.01).The levels of cells blocked in the G0/G1 phase(P0.01)were significantly more than thatinthecontrols.ThemigrationandinvasionnumbersinthemiR-495inhibitortransfectedgroupweresignificantly increased(P0.01)，and the apoptosis rate was significantly decreased(P0.01).The proportion ofS phase cells in the miR-495 inhibitor transfected group was increased(P0.05)，and the difference wasstatistically significant.Compared with the control group，expression of the RNF113A protein in the miR-495mimics transfected group was down-regulated(P0.05)，and expression of the RNF113A in the miR-495论著癌变畸变突变2 0 3CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS2023 年 5 月第 35 卷第 3 期inhibitor transfected group was up-regulated(P0.05).CONCLUSION：miR-495 promoted cell apoptosis，inhibited cell migration and invasionability，and regulated cell cycle distribution.Thus，miR-495 may mediate malignant phenotype of esophagealsquamous carcinoma cells by regulating expression of the RNF113A protein.【KEY WORDS】esophageal cancer；miR-495；RNF113A；malignant phenotype中国是食管癌发病率最高的国家，食管癌患者的5年总生存率通常低于20%，晚期食管癌患者的5年总生存率低于10%1-2，预后较差。环境和遗传因素均可导致食管癌的发生。有特殊饮食和生活方式的人，如经常食用腌制食品、热食品，长期饮酒和大量吸烟，更容易患食管癌3-4；携带某些突变基因的人对肿瘤的易感性更高5-6。外科手术是食管癌的常用治疗方法，但治疗效果欠佳7，因此，寻求早期食管癌特异性的诊断和治疗靶点具有重要意义8-9。微小RNA(miRNA，miR)是一种能与靶基因mRNA的 3-非翻译区(3-untranslated region，3-UTR)结合的内源性单链小分子RNA，长度约为22 nt且不编码蛋白质，其通过在转录后水平降解mRNA或抑制翻译来调节基因的表达10。miRNAs影响癌细胞的生物学行为，包括增殖、迁移、侵袭、细胞周期和凋亡，并在肿瘤的发生和发展中发挥作用11-13。miR-495作为较常见的miRNA，在多种肿瘤中异常表达，在食管癌中miR-495 表达下调，发挥抑癌基因的作用。目前，miR-495与其靶基因RNF113A在食管癌中的作用及调控机制尚不清楚。因此，本文将miR-495转染入人食管鳞癌细胞Eca109，探讨miR-495对食管鳞癌细胞恶性表型的影响及其分子机制。1材料与方法1.1细胞系及试剂人食管鳞癌细胞系Eca109购自武汉大学细胞典藏中心，DMEM(高糖)培养基、胰酶、青霉素-链霉素双抗购于 Gibco 公司，胎牛血清(FBS)购于 Excell Bio公司，CCK-8细胞增殖/毒性检测试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购于全式金生物公司，miRNA荧光定量PCR 试剂盒和蛋白预染 Marker 购于上海生工公司，LipofectaminRNAiMAX 购 于 ThermoFisher 公 司，TRIzolTMReagent 购于 Ambion 公司，Transwell 小室购于Corning公司，RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂购于博士德公司，-actin Loading Control Antibody购于义翘神州，Anti-RNF113A购于Abcam公司。miR-495模拟物(miR-495mimics)和 miR-49 抑 制 剂(miR-495inhibitor)购于通用生物公司。1.2细胞分组处理Eca109 采用 DMEM 培养基添加 10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗溶液置于37、饱和湿度、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，待细胞汇合率达70%时使用Lipofectamin RNAiMAX试剂进行转染。细胞分为模拟物对照组(mimics NC)、miR-495模拟物组、抑制剂对照组、miR-495抑制剂组，具体操作按照试剂说明书进行。1.3实时荧光定量PCR检测细胞中miR-495的表达水平提 取 各 组 细 胞 中 总 RNA，将 RNA 逆 转 录 为cDNA，根据实时荧光定量 PCR(quantitative real-timePCR，qPCR)试剂盒说明书的操作步骤进行扩增检测miRNA的表达，miR-495以U6为内参，采用2-CT法计算miR-495的相对表达量。1.4CCK-8试剂盒检测细胞增殖将各组Eca109细胞按照5104个/mL的浓度分别接种至96孔板，每孔100 L，于37、CO2体积分数为5%的培养箱中培养48 h，每孔加入100 L浓度为10%的CCK-8溶液，在培养箱中孵育1 h后，采用酶标仪测定各孔450 nm处吸光度值。1.5流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡将 Eca109 细胞调整为 1105个/mL 的单细胞悬液，接种至6孔板中，每孔2 mL，然后胰酶消化细胞，PBS冲洗，用预冷PBS重悬细胞，将一部分细胞悬液加入到3.5 mL预冷的80%乙醇中，4 固定过夜，离心、沉淀细胞。用预冷的PBS洗涤，加入500L PI/RNase染色缓冲液(staining buffer)重悬细胞并获得单细胞悬液。4 避