AP4在人脑胶质瘤组织中的表达及其对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响.pdf

收稿日期 2020-07-23摇 修回日期 2021-12-30作者单位 沈阳积水潭医院 神经外科,辽宁 沈阳 110027作者简介 王忠海(1973-),男,主任医师.文章编号 1000鄄2200(2023)05鄄0610鄄04临床医学AP4 在人脑胶质瘤组织中的表达及其对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响王忠海,李铁柱,周金鑫,杨培培摘要目的:探讨激活增强子结合蛋白 4(activating enhancer binding protein 4,AP4)在人脑胶质瘤组织中的表达及其对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:收集 29 例神经胶质瘤组织和癌旁组织,采用免疫组织化学技术、RT鄄qPCR 技术、Westernblotting 检测 AP4 在胶质瘤组织和癌旁组织中的表达。采用小干扰 RNA(siRNA)构建 AP4 敲除的 U251 和 U87 细胞系,采用CCK鄄8 实验、细胞划痕实验、Transwell 实验检测胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的改变。结果:AP4 蛋白在胶质瘤组织中阳性表达率为 72.41%(21/29),明显高于癌旁组织中的 31.03%(9/29)(P 0.01)。玉+域级、芋+郁级胶质瘤组织中 AP4mRNA 和蛋白表达水平均明显高于相应癌旁组织(P 0.01),且芋+郁级胶质瘤组织中 AP4 mRNA 和蛋白表达均高于玉+域级(P 0.05)。AP4 敲除后,U251 和 U87 细胞增殖能力均明显下降(P 0.01),迁移和侵袭能力亦均明显降低(P 0.01)。结论:AP4 在神经胶质瘤组织和细胞中高表达,且与胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力密切相关,可能成为神经胶质瘤不良预后的重要参考指标。关键词 胶质瘤;激活增强子结合蛋白 4;增殖;迁移;侵袭中图法分类号 R 739.41摇 摇 摇 文献标志码 A摇 摇 摇 DOI:10.13898/ki.issn.1000鄄2200.2023.05.013Expression of AP4 in human glioma tissue and its effecton the proliferation,migration and invasion of glioma cellsWANG Zhong鄄hai,LI Tie鄄zhu,ZHOU Jin鄄xin,YANG Pei鄄pei(Department of Neurosurgery,Shenyang Jishuitan Hospital,Shenyang Liaoning 110027,China)Abstract Objective:To investigate the expression of activating enhancer binding protein 4(AP4)in human glioma tissue and itseffect on the proliferation,migration and invasion of glioma cells.Methods:Tumor and adjacent tissues from 29 patients with gliomaswere collected.The expression of AP4 in glioma tissues and adjacent tissues were measured by immunohistochemistry,RT鄄qPCR andWestern blotting.Further,the AP4 knockout U251 and U87 cell lines were constructed using small interfering RNA(siRNA).The effectof AP4 knockdown on the proliferation,migration and invasion of glioma cells were detected by CCK鄄8,wound healing and Transwelltest.Results:The positive expression rate of AP4 protein in glioma was 72.41%(21/29),which was significantly higher than that inadjacent tissues 31.03%(9/29)(P 0.01).The expression levels of AP4 mRNA and protein in grade 玉+域 and 芋+郁 gliomaswere significantly higher than those in adjacent tissues(P 0.01),and the expression levels in grade 芋+郁 gliomas were higher thanthose in grade 玉+域(P 0.05).After AP4 knockout,the proliferation,migration and invasion of U251 and U87 cells decreasedsignificantly(P 0.01).Conclusions:The expression level of AP4 is aberrant upregulated in glioma tissues and cells,and is closelyrelated to the proliferation,migration and invasion of glioma cells.It can be a potential reference index for the poor prognosis.Key words glioma;activating enhancer binding protein 4;proliferation;migration;invasion摇 摇 神经胶质瘤是中枢神经系统常见、致死率较高的一种原发恶性肿瘤,约占该系统恶性肿瘤的47.1%1。因其生长速度快,无限增殖,肿瘤细胞与正常脑组织分界不清,具有高度侵袭性2,胶质瘤的预后并不理想,中位生存时间仅为 12 15 个月3。研究4发现,许多基因的异常表达与胶质瘤发生、发展密切相关,为胶质瘤预后以及治疗提供了新的研究方向。激活增强子结合蛋白 4(activatingenhancer binding protein 4,AP4)是一种 c鄄MYC 调节的转录因子,参与细胞增殖与分化、细胞周期等5,尤其在肿瘤细胞增殖和转移过程中发挥重要作用6。AP4 诱导细胞增殖主要通过作用 c鄄MYC 促进 DNA 复制,显著上调 CDK2 等蛋白表达,下调 p21和 p16 蛋白表达,影响细胞周期过程中的 G2/M 期和 S 期6。在胃癌中发现 miR鄄144 能够靶向结合在AP4 的 3忆UTR 区域,从而抑制 AP4 表达,抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭8。但目前尚少见关于 AP4在胶质瘤中的作用研究。本研究检测 AP4 在胶质瘤组织中的表达情况,同时在体外检测 AP4 对胶质016J Bengbu Med Coll,May 2023,Vol.48,No.5瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,以期为神经胶质瘤预后评估提供实验支持。现作报道。1摇 资料与方法1.1摇 一般资料摇收集 2018 年 8 月至 2019 年 8 月我院手术切除胶质瘤标本 29 例和对应的癌旁组织29 例。其中男18 例,女11 例;年龄53 88 岁;体质量 45 77 kg;胶质瘤玉、域级 15 例,芋、郁级 14 例。病人均为初发脑胶质瘤。将标本置于 0.9%氯化钠溶液中,去除血污后,置于液氮保存待用。本研究经本院伦理委员会审核批准,参与研究者均知情同意并签署知情同意书。1.2摇 方法摇1.2.1摇 免疫组织化学法检测 AP4 蛋白表达摇将胶质瘤组织和癌旁组织各 29 例切片后,于 60 益烘箱中烘烤20 min,随后二甲苯脱蜡两次,每次5 min,梯度乙醇进行脱水处理。3%双氧水甲醇处理切片,抑制内源性过氧化物酶活性。羊血清封闭组织切片2 h。抗 AP4 的抗体 1:500 处理切片,4 益过夜。第2 天 PBS 洗 3 次,加入二抗,随后二氨基联苯胺显色。1.2.2摇 RT鄄qPCR 技术检测 AP4 mRNA 表达摇 将胶质瘤组织和癌旁组织各 29 例组织样本剪碎后取25 mg置于 EP 管中,按照 100 滋L 氯仿/1 mL Trizol加入氯仿,振荡混匀 15 min,离心后吸取上层水相,至另一 RNase鄄free 离心管中,加入异丙醇混匀,静置10 min 后离心,RNA 沉于管底部。采用反转录试剂盒进行反转录,获得 cDNA。采用 SYBR 试剂盒进行RT鄄PCR,PCR 反应体系进行 40 个循环。引物序列见表 1。表 1摇 引物序列基因正向反向AP4AAC AGG GGC AGA GTG AGT TG鄄GGG AAG TGC CTT CGA CAG TGGAPDHACC ACA GTC CAT GCC ATC ACTCC ACC ACC CTG TTG CTG TA1.2.3摇Western blotting 检测 AP4 蛋白表达摇将胶质瘤组织和癌旁组织各 29 例组织样本按照细胞全蛋白 提 取 试 剂 盒 说 明 书 进 行 蛋 白 提 取,并 以Bradford 法测定蛋白浓度后-70 益 保存备用。用 15%SDS鄄PAGE 分 离 40 滋g 总 蛋 白,电 转 至NC 膜,用 TBST 配置5%的脱脂奶粉封闭1 h。加入1颐 1 000 稀释的抗体 AP4,4 益 孵育过夜,然后取出NC 膜,TBST 室温洗 3 次,每次 5 min。加入二抗室温孵育 1 h,洗膜 3 次,每次 5 min。在暗室按照 1颐 1比例混合发光底物 A、B 液。取出膜放入 Bio鄄Rad 显像仪。1.2.4摇 细胞培养、分组和细胞转染摇 人胶质瘤细胞系 U251 和 U87 细胞购自 ATCC 公司,培养于含10%FBS DMEM 培养基,37 益、5%CO2培养箱中培养,待细胞进入对数生长期进行实验。将 U251 和U87 细胞各分为 2 组:阴性对照组,即 NC鄄siRNA 组(转染无义序列 NC)和 AP4鄄siRNA 组(转染 si鄄AP4),由上海生工生物工程股分有限公司合成,参照 Lipofectamine 2000 说明书进行转染,放置 37 益、5%CO2培养箱中培养 6 h 后,更换完全培养基,培养 48 h 后待用。1.2.5摇细胞增殖实验摇将消化后的细胞制成 2 伊104/mL 细胞悬液,按每孔 100 滋L 接种于 96 孔板,按照转染试剂的说明书进行细胞转染。分别在转染后 24、48、72、96 h 进行检测,检测前4 h 在每个孔内加入 5 滋L CCK鄄8 溶液,检测前弃培养液,在酶标仪测定波长 450 nm 处吸光度值。每组 3 个复孔。1.2.6摇细胞划痕实验摇培养转染后 U251(NC鄄siRNA 组)、U251(AP4鄄siRNA 组)、U87(NC鄄siRNA组)、U87(AP4鄄siRNA 组)细胞 48 h,待细胞达到95%汇合后,每层细胞用无菌 10 滋L 吸管尖划伤刺激,用 PBS 冲洗 3 次,去除细胞碎片,继续无血清培养基孵育。分别在 0、24、48 h 用数码相机(Canon,日本)拍摄照片。细胞迁移率=各时间点细胞致伤区距离/原始细胞致伤区距离。1.2.7摇Transwell 实验摇以上 4 组细胞取 1 伊 106/mL 接种于 8 滋m 的含有基质凝胶的 transwell 小室中(Corning,美国),小室内加入无血清 DMEM,下室加入含 10%FBS DM