miR-34c抑制NLRP3炎性小体诱导的小胶质细胞焦亡机制研究.pdf

收稿日期 2021-03-30摇 修回日期 2022-07-27基金项目 安徽省高校自然科学研究重点项目(KJ2019A0364,2022AH051480);中国卒中学会脑血管病全程管理启航基金(2021);蚌埠医学院自然科学研究重点项目(2021byzd128)作者单位 蚌埠医学院第一附属医院 神经内科,安徽 蚌埠 233004作者简介 骆摇 嵩(1986-),男,硕士,副主任医师,副教授.文章编号 1000鄄2200(2023)05鄄0561鄄04基础医学miR鄄34c 抑制 NLRP3 炎性小体诱导的小胶质细胞焦亡机制研究骆摇 嵩,李摇 理,刘东亮,屈洪党摘要目的:探索 miR鄄34c 在调控 NLRP3 炎性小体激活 caspase鄄1 信号通路诱导小胶质细胞焦亡中的作用。方法:观察脂多糖(LPS)联合 ATP 激活小胶质细胞后,通过乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒检测 LDH 的释放,以判断小胶质细胞细胞膜的完整性;再对 miR鄄34c 转染后的小胶质细胞在 LPS 和 ATP 激活下,观察小胶质细胞细胞膜变化。采用细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK鄄8)分别检测 miR鄄34c 转染后的小胶质细胞和未转染的小胶质细胞在 LPS 和 ATP 刺激下活力变化情况。采用蛋白免疫印迹分别检测 LPS+ATP 诱导的小胶质细胞(对照组)中和 miR鄄34c 转染后小胶质细胞(观察组)中的蛋白表达情况,如 NLRP3 炎性小体、caspase鄄1、GSDMD、IL鄄1茁、IL鄄18。结果:LPS+ATP 联合诱导下的小胶质细胞较正常的小胶质细胞,miR鄄34c 表达减少(P 0.01);观察组小胶质细胞 LDH 释放水平较对照组下降(P 0.05)外,其他时间观察组均明显高于对照组(P 0.01);观察组中小胶质细胞中NLRP3 炎性小体、caspase鄄1、GSDMD、IL鄄1茁、IL鄄18 生成较之对照组小胶质细胞中炎性小体相关因子减少(P 0.01)。结论:miR鄄34c 可以抑制 LPS+ATP 诱导的小胶质细胞焦亡,可能通过降低 NLRP3 炎性小体活化及下游 caspase鄄1 依赖细胞焦亡信号通路关键蛋白表达有关。关键词 细胞焦亡;miR鄄34c;NLRP3 炎性小体;小胶质细胞中图法分类号 R 743.3摇 摇 摇 文献标志码 A摇 摇 摇 DOI:10.13898/ki.issn.1000鄄2200.2023.05.001Study on the mechanism of miR鄄34c inhibitingNLRP3 inflammasome鄄induced microglia pyrolysisLUO Song,LI Li,LIU Dong鄄liang,QU Hong鄄dang(Department of Neurology,The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Bengbu Anhui 233004,China)Abstract Objective:To explore the role of miR鄄34c in regulating NLRP3 inflammasome to activate the caspase鄄1 signaling pathwayto induce microglia pyrolysis.Methods:After the observation of lipopolysaccharide(LPS)combined with ATP for activating microglia,the release of lactate dehydrogenase(LDH)was detected using LDH cytotoxicity detection kit to determine the integrity of the microgliacell membrane;then,the microglia transfected with miR鄄34c are activated by LPS and ATP,which was observed for the changes in glialcell membrane;cell proliferation and toxicity detection kit(CCK鄄8)was used to detect changes in the viability of miR鄄34c transfectedmicroglia and untransfected microglia under the stimulation of LPS and ATP;Western blotting was used to detect the protein expressionin LPS+ATP鄄induced microglia and microglia after miR鄄34c transfection,such as NLRP3 inflammasome,caspase鄄1,GSDMD,IL鄄1茁,IL鄄18.Results:Compared with normal microglia,the expression of miR鄄34c in microglia induced by LPS+ATP combination decreased(P 0.01);the LDH release level of microglia in the observation group was lower than that in the control group(P 0.05),while the observation group was significantly higher than the control group at other times(P 0.01);the production of NLRP3inflammasome,caspase鄄1,GSDMD,IL鄄1茁 and IL鄄18 of microglia in the observation group was decreased compared with those in thecontrol group(P 0.01).Conclusions:MiR鄄34c can inhibit LPS+ATP鄄induced microglial pyroptosis,which may be related to thereduction of NLRP3 inflammasome activation and key proteins expression in the downstream caspase鄄1鄄dependent pyroptosis signalingpathway.Key words pyrolysis;miR鄄34c;NLRP3 inflammasome;microglia摇 摇 目前缺血性脑卒中已经成为我国常见的疾病之一,治疗手段有限,致残率高,死亡率高,复发率高,涉及到的病理生理过程复杂。挽救缺血半暗带是缺血性脑卒中治疗成败的关键,而在缺血半暗带区域同时也存在炎症反应,有学者形象地将其比作类似缺血半暗带的“炎症半暗带冶1-5。NLRP3 炎症小体过度表达和产生对于缺血性脑卒中进展加重都有不良影响。有研究发现,当发生大脑中动脉栓塞或165蚌埠医学院学报 2023 年 5 月第 48 卷第 5 期全脑发生缺血时,就会加剧促炎细胞聚集活化和NLRP3 炎性小体过度表达、产生,从而加剧缺血区域脑组织炎症免疫反应6-10。小胶质细胞焦亡在缺血脑组织固有炎症反应中有重要的作用11-12,其分泌炎症因子,召集更多的活化的炎性细胞,进一步加剧炎症反应,其自身焦亡现象导致炎症反应更趋扩大,通过调节缺血半暗带周边的炎症反应,避免M1 小胶质细胞焦亡对于保护缺血半暗带十分重要。MicroRNA(miRNA)是约 18 25 个核苷酸的内源性非编码小 RNA 分子,通过与靶基因的 3忆非翻译区(3忆鄄UTR)结合调控基因表达,促进细胞的增殖、分化和凋亡等过程13。据报道,miR鄄34 家族成员miR鄄34c 能通过调节血管平滑肌细胞钙化、内皮细胞衰老等影响糖尿病引起的血管衰老14。在对缺血性脑卒中病人进行基因分型中发现,miR鄄34c 的表达水平与缺血性脑卒中风险呈负相关关系15。提示 miR鄄34c 可能用于缺血性脑卒中的预测或治疗,但对于 miR鄄34c 的具体调控机制尚不清楚。因此,本研究旨在探讨 miR鄄34c 是否对 NLRP3 炎性小体所诱导的小胶质细胞焦亡具有抑制作用及可能的机制,为后续的缺血性脑卒中神经保护临床应用提供新的治疗靶点和实验依据。1摇 材料与方法1.1摇 细胞培养摇实验所用细胞是人源小胶质细胞HMC3,该细胞株源于北京北纳创联生物技术研究院,并于 37 益、5%CO2、CM8鄄1 培养液条件下进行培养。1.2摇 主要试剂摇miR鄄34cmimics 和 miR鄄NC 购自上海佰欧晶生物科技有限公司;一抗人抗兔 NLRP3 和GSDMD 抗体(武汉爱博泰克公司);ATP 由生工生物工程(上海)公司提供;脂多糖(LPS)由上海源叶公司提供;乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(碧云天公司);SuperScript芋 Reverse Transcriptase 购自赛默飞生物化工制品有限公司;Power Up SYBR GreenMaster Mix 购自赛默飞公司;组织总蛋白提取试剂(T鄄PER tissue protein extraction reagent)和抑制剂(halt proteaseand phosphatase inhibitor cocktail)购自赛默飞公司;BCA 蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购自上海碧云天公司;引物购自上海生工生物工程公司,CCK8 试剂盒购自迈克生物公司。1.3摇 方法摇1.3.1摇 LDH 检测摇 首先将对数生长期的 HMC3 细胞以 5 伊103个/孔进行铺板(96 孔板)。选择 5 个孔加入含 100 ng/mL LPS 的培养基培养 24 h。含100 ng/mL LPS 的培养基培养 HMC3 细胞24 h 后更换含 5 mmol/L ATP 的培养基培养 30 min,去除上清,PBS 冲洗 2 遍。每孔加入 100 滋L 无血清培养基。细胞培养板放入离心机(400 g)5 min 后,每孔取上清 60 滋L,随后加入 60 滋 LLDH 的检测液并加入到新的 96 孔板中。放入摇床避光混匀 30 min。利用酶标仪以490 nm 波段检测。INT 溶液(1 伊)的配制:首先把 10 伊 的 INT 溶液稀释为 1 伊 的 INT 溶液,稀释为总量为 400 滋L INT(1 伊)溶液,其中稀释比例(1颐 10),试剂现配现用。LDH 检测工作液的配置:取乳酸溶液 400 滋L,INT 溶液(1 伊)400 滋L,酶溶液 400 滋L,进行混匀。1.3.2摇CCK鄄8 检测摇取各组细胞在 96 孔板中以5 000 个/孔的细胞密种板。CCK8 铺板后的细胞更换含 100 ng/mL LPS 的培养基培养 24 h 后,更换含5 mmol/L ATP 的培养基培养 30 min,CCK8 实验的细胞更换完全培养基,每孔 100 滋L。CCK8 实验每孔加入10 滋L 的 CCK8 溶液,培养箱孵育2 h 后再酶标仪于450 nm 检测吸光度,连续检测5 d,每天相同的时间加入 10 滋L CCK8 溶液,培养箱孵育2 h 后进行检测。1.3.3摇Western blotting 检测摇各组细胞培养到80%90%时,胰酶消化后,离心后加入 RIPA 蛋白裂解液,冰上裂解 30 min