可持续释放NO的SNAP导尿管抗菌性能研究.pdf

第 50 卷 第 3 期2023 年北京化工大学学报(自然科学版)Journal of Beijing University of Chemical Technology(Natural Science)Vol.50,No.32023引用格式:郑伟涛,胡康洪.可持续释放 NO 的 SNAP 导尿管抗菌性能研究J.北京化工大学学报(自然科学版),2023,50(3):69-75.ZHENG WeiTao,HU KangHong.Antibacterial properties of S鄄nitroso鄄N鄄acetylpenicillamine(SNAP)impregnated urinarycatheters with sustainable release of NOJ.Journal of Beijing University of Chemical Technology(Natural Science),2023,50(3):69-75.可持续释放 NO 的 SNAP 导尿管抗菌性能研究郑伟涛1,2,3摇 胡康洪1,2,3*(湖北工业大学 1.中德生物医学中心;2.工业发酵省部共建协同创新中心;3.国家外专局/教育部细胞调控与分子药物“111冶引智基地,武汉摇 430068)摘摇 要:参照文献方法合成了 S鄄亚硝基鄄N鄄乙酰青霉胺(SNAP),将硅胶导管浸入 SNAP 溶液中,制备了 SNAP 导尿管,并测定了 NO 释放量;考察了 SNAP 导尿管对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的体外抑菌性能;采用绵羊为动物模型进行体内留置导尿管实验,考察 SNAP 导尿管的体内抗菌性能。结果显示:SNAP导管在第一天的 NO 释放量可达 1郾 8 伊10-10mol/(min cm2),此后 NO 释放量逐渐下降并可持续释放 20 天;SNAP导尿管对金黄色葡萄球菌具有较为明显的抑菌作用,垂直插入法和平行放置法测得的抑菌圈直径分别为 2郾 59 mm和 2郾 75 mm,但 SNAP 导尿管对其他细菌没有抑菌作用;在体内抗菌活性测定实验中,在监测17 天后,在 SNAP 导尿管组的绵羊尿液中未检测到细菌,而在纳米银导尿管组和硅胶导尿管组的绵羊尿液中均检测出含菌量逸105cfu/mL,表明 SNAP 导尿管具有较好的体内抗菌性能。关键词:SNAP 导尿管;抗菌性能;抑菌圈;金黄色葡萄球菌中图分类号:O69摇 摇 DOI:10.13543/j.bhxbzr.2023.03.008收稿日期:2023-01-10基金项目:湖北省重点研发计划项目(社会发展领域)(2022BCA018)第一作者:男,1976 年生,博士生*通信联系人E鄄mail:hukh 引摇 言近年来,疾病的多发使得临床导尿管的使用量逐渐增多,留置导管是医院为患者解决不能自主排尿的主要方案,然而,长期留置导管会导致细菌感染1。导管相关性尿路感染(catheter鄄associated uri鄄nary tract infection,CAUTI)是由长期在患者体内留置导管造成的,是医院常见的细菌感染之一,可引起许多医疗并发症,例如导管结痂、膀胱结石、败血症、内毒素休克和肾盂肾炎2-3。因此,如何减少和预防 CAUTI 的发生是临床上亟待解决的问题。造成CAUTI 的主要原因为细菌易在导管表面黏附并形成难以清除的生物膜,该过程涉及的主要细菌包括大肠埃希菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等4-5。面对临床的迫切需求,开发具有抗菌效果的导尿管成为科研工作者及医疗保健企业等共同关注的重点。目前,临床上应对 CAUTI 的主要策略是对导管材料表面进行物理及化学方面的修饰改性(如涂敷抗菌涂层),使其可以将杀菌剂释放到环境中,从而起到持续的抗菌及杀菌效果,这是预防生物膜形成的有效手段之一6-9。近年来,一氧化氮(NO)作为抗菌剂在生物抗菌领域得到广泛应用。NO 是一种内皮源性舒张因子,研究发现,其反应副产物如 N2O3和 ONOO-(过氧亚硝酸盐)可通过氧化和亚硝基化应激,对微生物蛋白质、DNA、代谢酶和外膜结构造成氧化和亚硝基化损伤,从而改变重要的蛋白质功能并诱导细菌细胞死亡,从而根除细菌10-11。NO 作为杀菌剂已被证明可以对抗广泛的革兰氏阴性菌(如铜绿假单胞菌和大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌),以及耐药细菌(如 耐 甲 氧 西 林 金 黄 色 葡 萄 球 菌(MR鄄SA)12-13。已有研究证明 NO 释放可以有效防止细菌黏附14,采用模拟内源性 NO 释放的聚合物材料抗菌提供了一种潜在的解决医疗器械相关感染的方法。S鄄亚硝基鄄N鄄乙酰青霉胺(SNAP)是一种成本低、安全性高的 S鄄亚硝基硫醇(RSNO)类NO 供体,可以分解并释放 NO,其中 RSNO 是一类新兴的内源性和外源性 NO 供体。当 SNAP 掺入吸水率非常低的聚合物时,可长期持续释放 NO。Wo 等15制备了一种 SNAP 掺杂的 CarboSil 聚合物导管,在生理通量水平上该导管可持续释放 NO超过 3 周,实验结果表明其可以显著降低细菌的生存能力。然而,目前关于 SNAP 导尿管抗菌性能的研究仍缺乏在大动物模型上的进一步评价。因此,本文制备了可持续释放 NO 的 SNAP 导尿管,评价了其在体外及绵羊体内的抗菌性能,以期为SNAP 导尿管的临床应用提供参考。1摇 实验部分1郾 1摇 实验材料和仪器1郾 1郾 1摇 实验材料一次性使用无菌硅胶导尿管,广州维力医疗器械股份有限公司;纳米银抗菌导尿管,美昕医疗器械(上海)有限公司;金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠 埃 希 菌(ATCC8739)、铜 绿 假 单 胞 菌(ATCC9027)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)(ATCC10031),武汉大学中国典型培养物保藏中心;胰酪胨大豆肉汤(TSB)培养基、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基,广东环凯微生物科技有限公司;血管鞘(402-606X),北京迪玛克医药科技有限公司;泌尿道引导丝(1001780-HC),张家港市华美医疗器械有限公司;一次性使用球囊压力泵(SM-ID-A2530H-TB),深圳市昕力医疗设备开发有限公司;Y 型阀(DMK-Y)、三通(409511CN)、指引导管(LA6JR40)、丙泊酚,四川国瑞药业有限责任公司;舒泰,北京佑宠生物科技有限公司;异氟烷,友诚生物科技有限公司;0郾 9%生理盐水,河南科伦药业有限公司;肝素钠注射液,齐鲁制药有限公司;注射用青霉素钠,瑞阳制药有限公司;非吸收性外科缝线,扬州环宇医疗器械有限公司;N鄄乙酰鄄D鄄青霉胺(N鄄acetyl鄄D鄄penicillamine,NAP)、亚硝酸钠(NaNO2),Sigma-Aldrich 公司;PBS 缓冲液(pH7郾 2 7郾 4),Gibco 公司;盐酸(HCl)、丙酮、乙醚、四氢呋喃(THF),均为分析纯,国药集团化学试剂北京有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA),纯度逸99郾 5%,北京索莱宝科技有限公司。雌性绵羊,30 40 kg,来源于浓浓(北京)生物科技有限公司。常温饲养,每笼一只,普通饲料喂养,每只每天供给其体重 5%的饲料,自由摄食,自由饮水,每天冲洗清洁羊笼,直至实验结束。实验动物福利与伦理审查预先经湖北工业大学中德生物医学中心生命科学研究伦理审查委员会批准。1郾 1郾 2摇 实验仪器紫外可见分光光度计(UV-Vis)(UV-752),Shimadzu 公司;一氧化氮分析仪(Nitric Oxide Analy鄄zer)(NOA 280i),美国通用电气集团分析仪器公司;恒温培养摇床(ZHWY-1102C),上海智诚分析仪器制造有限公司;离心机(Sorvall Legend Micro 17),Thermo Scientific 公司;恒温恒湿培养箱(DNP-9082),上海精宏实验设备有限公司;呼吸麻醉机(ACM608),北京航天长峰公司;呼吸机(SV350)、除颤仪(BeneHert D6),深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。1郾 2摇 SNAP 的合成按照文献16的方法合成 SNAP。称取0郾 478 gNAP 溶解于 8郾 0 mL 水(含有 2郾 5 mL 的 1郾 0 mol/LHCl)中,加入 0郾 173 g NaNO2,在 5 益下搅拌 40 min后,用 5 mL 丙酮处理该溶液并继续搅拌 10 min。抽滤除去绿色沉淀物,用冰水洗涤 5 次,用 10 mL 丙酮和乙醚的混合溶剂洗涤 3 次,得到产物 SNAP,置于真空干燥箱中干燥。使用紫外可见分光光度计在200 700 nm 的范围内记录 UV-Vis 光谱。1郾 3摇 SNAP 导尿管的制备参照文献17 的方法制备 SNAP 导管。将SNAP 溶解在 THF 中 15 min(SNAP 的质量浓度为125 mg/mL),然后将一次性使用无菌硅胶导管在黑暗中完全浸入含有 SNAP 的 THF 溶液中 2 h。在该溶胀/浸渍期之后,在通风橱中将导管在黑暗环境下干燥 72 h 以去除残留溶剂,得到 SNAP 导尿管。1郾 4摇 NO 释放量测定将 SNAP 导管剪成长度为 1 cm 的小段,将导管段放置在琥珀色玻璃瓶中,瓶内装有 4 mL PBS 缓冲液(pH 7郾 4)和 100 滋mol/L EDTA(浸入 37 益 水浴中),使用一氧化氮分析仪测定 SNAP 导管的 NO 释07北京化工大学学报(自然科学版)摇 摇 摇 摇 摇 摇摇摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2023 年放量。NO 持续产生后,立即被 N2扫气和鼓泡器净化并扫入化学发光检测室。在测定 NO 释放量期间,将所有导管置于新鲜的 PBS 缓冲液中,并且在每次测量后在没有环境光的条件下于 37 益孵育。1郾 5摇 体外抗菌性能评价1郾 5郾 1摇 菌液制备将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌加入 TSB 培养基中振荡培养,在(37 依2)益的条件下培养至其菌液的 OD600(600 nm波长下的吸光度值)为 0郾 45 左右,此时菌液浓度通常为 106 107cfu/mL,各试验菌种的浓度如表 1所示。表 1摇 受试菌种的浓度Table 1摇 Concentrations of the tested bacteria试验菌种菌液浓度/(cfu mL-1)金黄色葡萄球菌4郾 05 伊107大肠埃希菌3郾 20 伊107铜绿假单胞菌4郾 75 伊106肺炎克雷伯菌4郾 15 伊1071郾 5郾 2摇 导尿管预处理将制备的 SNAP 导尿管剪成长度为 1 cm 的小段,阴性对照样品(一次性无菌硅胶导尿管)与阳性对照样品(纳米银抗菌导尿管)均制成与受试样品等长的小段。1郾 5郾 3摇 试验菌接种将 200 mL TSA 培养基(融化后用水浴冷却至45 益左右)与 20 mL 新鲜培养的菌液充分混合,然后倒在平板上,在培养基未凝固时用无菌镊子将长度为 1 cm 的导尿管分别垂直插入和平行放置于TSA 平板培养基中。每个平板放置 1 个 SNAP 导尿管、1 个纳米银抗菌导尿管和 1 个一次性无菌硅胶导尿管,每两个样品之间距离 25 mm 以上,样品与平板边缘距离 15 mm 以上,然后盖上培养皿等待凝固。1郾 5郾 4摇 培养与观察待培养基凝固后,将其置于 37 益培养箱中培养16 18 h,取出观察是否有抑菌圈产生,并选取均匀的抑菌圈测量其直径。1郾 6摇 体内抗菌性能评价1郾 6郾 1摇 实验分组将 24 只绵羊平均分成 4 组,每组 6 只。其中 1组为正常饲养对照组,另外 3 组为实验组:SNAP 导尿管组、纳米银抗菌导尿管组、一次性硅胶导尿管组。1郾 6郾 2摇 绵羊导尿管留置模型的构建参照文献18的方法构建绵羊导尿管留置模型。将