结直肠癌样本免疫细胞浸润及肿瘤突变负荷分析.pdf

1 7 2CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS论著癌变畸变突变Vol.35No.3May 2023收稿日期：2023-01-23；修订日期：2023-03-16基金项目：河南省重点研发与推广专项(212102310183)；郑州大学大学生创新创业训练计划项目(2022cxcy682)作者信息：王娜，E-mail：。*通信作者，轩小燕，E-mail：结直肠癌样本免疫细胞浸润及肿瘤突变负荷分析王娜1，王平2，何仪佳1，曾晶1，韩聪玲1，王思睿1，轩小燕1，*(1郑州大学基础医学院，河南郑州450001；2黄河科技学院，河南郑州450006)Bioinformatic analysis of immunecell infiltration and tumor mutationburden in colorectal cancerWANG Na1,WANG Ping2,HE Yijia1,ZENG Jing1,HAN Congling1,WANG Sirui1,XUAN Xiaoyan1,*(1.School of Basic Medical Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001;2.Huanghe S&T University,Zhengzhou 450006,Henan,China)【摘要】目的：采用生物信息学方法分析结直肠癌(CRC)样本免疫细胞浸润以及肿瘤突变负荷。方法：用CIBERSORT和ESTIMATE算法计算CRC样本中各免疫细胞的相对比例，用Spearman检验分析免疫细胞之间的相关性。基于CRC样本免疫细胞浸润比例的相似性，用ConsensusClusterPlus将样本分为免疫细胞聚类A和免疫细胞聚类B两群，Kaplan-Meier分析群间样本总生存期差异。构建CRC样本免疫细胞评分模型，依据样本免疫细胞评分，将CRC样本分为免疫细胞评分高、低两组，Kaplan-Meier分析组间样本总生存期差异，采用基因集富集分析(GSEA)研究免疫细胞评分高、低两组的基因集富集通路。整理突变数据，计算肿瘤突变负荷，依据肿瘤突变负荷将样本分为肿瘤突变负荷高、低两组。用maftool绘制突变瀑布图，用Kaplan-Meier分析肿瘤突变负荷高、低两组样本总生存期差异。结果：免疫细胞聚类A、B两群样本总生存期差异无统计学意义(P0.05)，免疫细胞评分高组患者的总生存期较免疫细胞评分低组患者长(P=0.005)。与肠道生理功能密切相关的通路在免疫细胞评分高组样本中富集，与肿瘤形成、发展和转移密切相关的通路在免疫细胞评分低组样本中富集。肿瘤突变负荷在免疫细胞评分高、低两组间差异无统计学意义(P0.05)，APC、TP53和KRAS基因突变频率在免疫细胞评分高、低两组样本中均较高，肿瘤突变负荷低组CRC患者总生存期长于肿瘤突变负荷高组患者(P=0.035)。结论：免疫细胞评分高组CRC患者总生存期长于免疫细胞评分低组患者，肿瘤突变负荷低组CRC患者总生存期长于肿瘤突变负荷高组患者。【关键词】结直肠癌；免疫细胞浸润；肿瘤突变负荷；生物信息学分析中图分类号：R730.3文献标志码：A文章编号：1004-616X(2023)03-0172-06doi：10.3969/j.issn.1004-616x.2023.03.002【ABSTRACT】OBJECTIVE：Expression of immune cell infiltration(ICI)and tumor mutation burden(TMB)in colorectal cancer(CRC)samples were analyzed using bioinformatic analysis.METHODS：The CIBERSORTand ESTIMATE algorithms were used to calculate relative fractions of immune cells in CRC samples，and theSpearman test was used to analyze correlations among infiltrating immune cells.The ConsensusClusterPlus wasused to cluster the CRC samples into ICI cluster A and ICI cluster B based on similarity of the relativefractions of immune cell infiltration.The overall survival(OS)of patients were analyzed by Kaplan-Meier.TheICI score model of CRC samples was constructed based on the signature gene A and signature gene B，andICI scores of each CRC samples were calculated.CRC patients were divided into two groups based on the ICIscores：ICI score High and Low.The OS of patients were analyzed by Kaplan-Meier，and GSEA was used toanalyze the enrichment pathways in each group.TMB was calculated and presented by maftool.Based on theTMB，the CRC patients were divided into H-TMB and L-TMB.The OS of patients between two groups wereanalyzed by Kaplan-Meier.RESULTS：There was no statistical difference in OS between patients in ICIclusters A and B.However，patients in the ICI score high group had longer OS than those in the ICI scorelow group.Gene sets which were closely related to intestinal physiological functions were enriched in the ICIscore high samples，while gene sets which were closely related to tumor formation，development and metastasiswere enriched in the ICI score low group.There was no significant difference in TMB between ICI score low论著癌变畸变突变1 7 3CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS2023 年 5 月第 35 卷第 3 期and ICI score high samples.The frequencies of KRAS，TP53 and APC were the highest compared with that ofother genes in both the ICI score low and high groups.The patients in the L-TMB group had longer OS thanthose in the H-TMB group.CONCLUSION：CRC patients in the ICI score high group had longer OS thanthose in the ICI score low group，and patienets in the L-TMB group had longer OS than those in the H-TMBgroup.【KEY WORDS】colorectal cancer；immune cells infiltration；tumor mutation burden；bioinformatic analysis结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球发病率第3、死亡率第4的肿瘤，每年有超过120万新增病例，60多万人死于CRC1-3。手术是目前治愈早期CRC的主要方法，但由于起病隐匿，多数患者发现时已有转移。化疗、放疗等延长了晚期CRC患者生存期，但治疗效果并不持久，耐药性不可避免地通过各种机制产生4。基因突变尤其是驱动基因如APC、TP53、KRAS的突变在不同肿瘤中突变频率不同，是影响肿瘤发生发展的重要因素5-7，同时也影响肿瘤靶向治疗效果。以免疫检查点抑制剂尤其是PD-1/PD-L1为代表的肿瘤免疫治疗是近年发展起来的非常有前景的治疗方法，在一些晚期CRC患者中具有显著疗效，但研究发现仅对微卫星不稳定性转移性CRC患者有效8，获益人群有限，仍急需开发新的治疗方法。研究CRC的肿瘤免疫细胞浸润微环境、基因突变图谱可为深入探讨CRC发生发展的分子机制以及为CRC的靶向治疗或免疫治疗提供理论基础。转录组测序技术以及生物信息技术的发展，可以帮助我们多维度分析免疫细胞浸润、肿瘤细胞突变等影响肿瘤发生、发展、转移及治疗等重要因素。本文分析了来自癌症基因组图谱集(The Cancer GenomeAtlas，TCGA)和基因表达综合数据库(Gene ExpressionOmnibus，GEO)的CRC样本的免疫细胞浸润、基因集富集通路、肿瘤突变负荷等信息，为进一步研究CRC发生和转移的分子机制提供生物信息学数据支撑。1材料与方法1.1数据来源从美国国家癌症研究所TCGA数据库(https:/portal.gdc.cancer.gov/)下载473例CRC样本转录组表达数据、452例CRC患者临床信息数据以及399例CRC患者突变数据。从美国国家生物信息技术中心GEO数据库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下 载 GSE40967 数 据集，含 585 例 CRC 患者样本芯片表达数据及临床信息，所有数据下载日期为2022年3月8日。依据文献方法9将来自TCGA数据库中的CRC样本基因表达数据由FPKM转化为TPM后，与GSE40967数据集的样本表达数据合并作为本文基因表达分析文件，采用ComBat算法对数据进行批次校正。整理合并TCGA及GEO临床数据作为后续生存分析文件，在R4.2.0版本下运行数据。1.2CRC免疫细胞浸润分析采用 CIBERSORT 和 ESTIMATE 算法分析 CRC 样本基因表达数据，获得样本免疫评分、基质评分以及22种免疫细胞在样本中的比例10。采用Spearman检验分析样本中免疫细胞浸润程度、免疫评分和基质评分之间的相关性。根据CRC样本各免疫细胞比例的相似性，用ConsensusClusterPlus将样本聚类为免疫细胞聚类A、B两组，采用pheatmap包绘制免疫细胞浸润热图。采用Kaplan-Meier分析免疫细胞聚类A、B两组间样本总生存期的差异。采用limma包分析PD-L1基因表达在免疫细胞聚类A、B两组间的差异。1.3免疫细胞评分模型的构建及样本的生存分析和基因集富集分析采用limma包分析免疫细胞聚类A、B两组间样本的所有差异表达基因(differentiall