‘金冠’苹果PP2C基因克隆及低温胁迫下的表达.pdf

h t t p：/bnxb cbp k do i：10.13473/k i.issn.1002-3186.2023.0201北京农学院学报2023,38(2)：1-5 Jo u rnal o f Beijing Universit y o f Agricu l t u re金冠苹果PP2CPP2C基因克隆及低温胁迫下的表达杨 玲，董美琳，肖全鑫，卢艳芬*(北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京重点实验室，北京102206)摘 要：【目的】为了鉴定并探究苹果MdPP2C基因对低温胁迫的响应机制。【方法】利用基因克隆技术，从苹 果金冠cDNA中克隆得到3个苹果MdPP2C基因，利用生物信息学技术对3个基因的理化性质、系统进化 及保守基序等进行分析，并采用real t ime-q PCR技术检测其在4 C低温处理下的表达情况。【结果】序列分析结 果表明，克隆得到的MdHABl、MdHAI2和MdAHG3分别编码544、405和432个氨基酸，其预测的表观相对 分子质量分别为5&26 k Da、44.29 k Da和45.80 k Da,理论等电点分别为5.03、6.63和5.01,均属于酸性蛋 白；3个蛋白均属于不稳定蛋白和亲水蛋白，3个蛋白均无跨膜结构，主要定位于细胞核和叶绿体，且3个基因 编码的氨基酸序列均具有PP2C超家族保守结构域；real t ime-q PCR结果表明，低温处理后，MdHABl.MdHAIZ和M/AHG3转录水平均呈现持续上调的趋势。【结论】从金冠中克隆的3个PP2C家族基因均参 与苹果金冠对低温胁迫的响应，以上结果为探究苹果PP2C家族基因在苹果属植物对低温胁迫的响应过程 及调控机制提供理论基础，为使用分子育种手段培育苹果耐寒性砧木提供新的基因。关键词：苹果；基因克隆；蛋白磷酸酶；生物信息学；表达；分析 中图分类号-S661.1 文章编号=1002-3186(2023)02-0001-05 文献标志码：ACloning and expression of PP2C genes response t o low t emperat ure in apple 6 Golden Delic iousYANG Ling,DONG Meil in,XIAO Qu anxin,LU Yanfen*(Co l l ege o f Pl ant Science and Tech no l o gy?Beijing Universit y o f Agricu l t u re/Beijing Key Labo rat o ry o f Agricu l t u ral Ap p l icat io n New Tech no l o gy,Beijing,102206,Ch ina)Abst rac t:QObject iveTo ident ify and exp l o re t h e resp o nse mech anism o f MdPP2C genes t o l o w t emp erat u re st ress in ap p l e.Met h o dsTh ree MdPP2C genes were cl o ned fro m t h e cDNA o f 4 Go l den Del icio u s?by gene cl o ning t ech no l o gy Bio info rmatics anal ysis t ech no l o gy was u sed t o anal yze p h ysical and ch emical p ro p ert ies,p h yl o genet ic evo l u t io n,and co nserved mo t ifs o f t h e t h ree genes and t h e exp ressio n u nder l o w t emp erat u re st ress was det ect ed by real t ime-q PCR.Resu l t s Seq u ence anal ysis sh o wed t h at t h e cl o ned MdHABl,MdHAI2 and MdAHG3 enco ded 544,405 and 432 amino acids,and t h eir p redict ed ap p arent rel at ive mo l ecu l ar weigh t s were 58.26 k Da,44.29 k Da and 45.80 k Da,resp ect ivel y,and t h eo ret ical iso el ect ric p o int s were 5.03,6.63 and 5.01,wh ich bel o nged t o acidic p ro t eins.Al l t h ese t h ree p ro t eins bel o ng t o u nst abl e p ro t ein and h ydro p h il ic p ro t ein,h ave no t rans-membrane st ru ct u re and are mainl y l o cal ized in t h e nu cl eu s and ch l o ro p l ast.Mo reo ver t h e amino acid seq u ences enco ded by t h e t h ree genes al l h ave t h e PP2C su p erfamil y co nservat ive do main Th e real t ime-q PCR resu l t s sh o wed t h at t h e exp ressio n o f MdHAB 1,MdHAI2 and MdAHG3 genes were co nsist ent l y u p-regu l at ed u nder 4 C l o w t emp erat u re t reat ment.Co ncl u sio nTh e t h ree MdPP2C famil y genes cl o ned fro m 6 Go l den Del icio u s were al l invo l ved in t h e resp o nse t o l o w t emp erat u re st ress.Th e resu l t s p ro vide a insigh t int o t h e mo l ecu l ar mech anism by wh ich PP2C famil y genes regu l at e l o w t emp erat u re st ress in ap p l e,and p ro vide candidat e genes fo r breeding co l d t o l erance ap p l e variet ies.收稿日期：2022-11-16基金项目：国家自然科学基金资助项目(31872081)第一作者：杨玲，女，硕士研究生，研究方向为果树种质资源利用与创新，Tel:18185665145,E-mail：yangl ingg0222 163.co m通信作者：卢艳芬，女，副教授，博士，从事果树种质资源利用与创新研究，Tel：13717774146,E-mail：icel u l126.co m2北京农学院学报第38卷Keywo rds：ap p l e；gene cl o ning$PP2C-t yp e p ro t ein p h o sp h at ase；苹果属于蔷薇科(Ro sace ae)苹果属(.Malus),是中国栽培面积最广的果树，主要分布于北温带，包括亚洲、北美洲和欧洲。随着全球气候骤变，中 国苹果的生产受到影响，低温冻害严重影响了果树 生长发育和果实品质产量，因此，提高苹果的耐寒 性逐渐成为苹果砧木育种的重要目标。脱落酸(abscisic acid,ABA)是一种重要的植物 激素，对植物生长发育过程如气孔关闭、种子萌发 等方面有着显著的调控作用，同时对干旱、低温及 盐胁迫等非生物胁迫有一定的适应调节能力阂。PP2C(PP2C-t yp e p ro t ein p h o sp h at ase)是一类活性 依赖于Mg?+和Mr?+的进化保守的单体丝氨酸/苏 氨酸残基蛋白磷酸酶金门，在古细菌、细菌、真菌和动 植物中广泛存在。在高等植物中,PP2C是ABA 信号转导途径调控植物生长发育的一个关键因 子刀，早前研究表明-PP2C被确定为ABA信号转 导通路的主要成分，在拟南芥中，ABA能够诱导 PP2C基因的表达,PP2C发挥着负调控ABA信号 的作用,PP2C活性降低会增强植物对ABA的响应 能力卩叭在拟南芥中，A BI1(A BA INSENSITIVE 1),ABI2(ABA INSENSITIVE2)、PP2CA(protein phosphatase 2C A),HA B1(HYPERSENSITIVE TO A BA I)和 A HG 1(A BA-hy per sensitive germination 1)等基因，均编 码PP2C蛋白m，低温处理条件下,A BI1基因表 达呈现先上升后下降趋势间，这表明PP2C s参与 ABA调控的抗冷信号转导。在干旱胁迫下,A BI1 和HA B1协同负调控ABA信号转导，和 HA B1的单突变体和双突变体均对ABA的敏感性 增强，导致植株抗旱性增强。在苹果属植物中，NIU14等人通过对不同果园密度的苹果树的转录 组数据分析发现-PP2C参与苹果属植物的光合作 用,影响植物的生长发育，此外，研究发现在苹果、棉花、苜蓿等物种中,PP2C家族基因的表达量能 被冷害、高温、干旱及盐胁迫等逆境所诱导“切，证 明了在高等植物对逆境胁迫的响应中,PP2C家族 基因发挥着重要作用。本研究通过利用现代分子生物学以及生物信 息学手段,从苹果金冠中克隆了 3个PP2C家族 基因，并通过分析其在低温处理下的表达模式，旨 在为探究苹果PP2C家族基因参与调控植物低温 胁迫分子机制提供理论依据，为使用分子育种手段bio info rmat ics；gene exp ressio n；anal ysis培育苹果耐寒性砧木提供新的基因。1材料与方法1.1试验材料以25 d生长健壮的苹果金冠!(Malus domestic a Borkh.4Go l den De l icio u s组培苗叶片为试验 材料，植物材料保存于北京农学院组培中心，培养 于 MS 培养基(4.43 g MS+30 g/L 蔗糖+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA)中，环境温度控制 在23 C+2 C,相对湿度调节在60%80%,光 照强度控制在1 8002 000 l x,光照条件控制为16 h光照+8 h黑暗。1.2试验方法1.2.1 金冠组培苗叶片总RNA的提取与 cDNA 的合成 参照 Fast Pu re Universal Pl ant To t al RNA Iso l at io n Kit(南京诺唯赞生物科技股 份有限公司)提取金冠组培苗叶片总RNA。提取 获得的总RNA质量通过凝胶电泳进行检测，总 RNA浓度通过紫外分光光度计测定。提取到总 RNA后，通过Ev。M-MLV反转录试剂盒(湖南艾 科瑞生物工程有限公司)进行金冠cDNA合成。1.2.2 金冠MdHA B 1 yMdHA I2,MdA HG 3 基 因克隆 根据在NCBI上已登录的拟南芥A tHA I2(AT1G07430)、A/AHG3(AT3G11410),AfHABl(AT1G72770)3