铅诱导离体神经干细胞氧化应...蓄积及MitoQ的保护作用_姚金余.pdf

DOI:10.13276/j.issn.2097-1656.2023.03.005军事预防医学专题铅诱导离体神经干细胞氧化应激和铜蓄积及 MitoQ 的保护作用姚金余1，2，王涛1，邹远康1，赵子瑜1，2，官瑞丽1，郑刚1(1空军军医大学军事预防医学系，特殊作业环境危害评估与防治教育部重点实验室，陕西 西安 710032;2陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)基金项目:国家自然科学基金(81920108030，81773378);空军军医大学军事医学珠峰工程人才计划项目(2020rcfczg)作者简介:姚金余，硕士研究生，从事环境毒理学研究，Tel:17738044409，E-mail:1821971025 通信作者:郑刚，Tel:13572131314，E-mail:zhenggang 网络首发:https:/ 目的研究铅离子(Pb2+)暴露对神经干细胞(NSC)氧化应激和诱导铜蓄积的作用，探讨 MitoQ的抗氧化保护作用。方法C17.2 神经干细胞用 2.5、5、10、20 mol/L Pb(Ac)2分别暴露24 h 和48 h，建立低剂量 Pb2+暴露体外模型，并设置对照组 0 mol/L Pb(Ac)2。MTT 法检测细胞活力;活性氧荧光探针(DCFH-DA)检测细胞活性氧自由基(OS)含量;TBA 法测定细胞丙二醛(MDA)含量;黄嘌呤氧化酶法测定细胞内超氧化物歧化酶 1(SOD1)的活性;原子吸收分光光度法检测细胞铜吸收;Western blotting 检测细胞内铜转运体 CT1、ATP7A 和 ATP7B 蛋白水平。结果与对照组相比，2.5 20 mol/L Pb2+暴露 24 h 或 48 h 后，对细胞活力产生显著的抑制作用，而细胞 OS 和 MDA 水平、SOD1 活性均显著高于对照组(P 0.01，P 0.05);不同浓度 Pb2+暴露后细胞内铜水平显著增高(P 0.05)，CT1 蛋白水平增高(P 0.05)，而 ATP7A、ATP7B蛋白表达均显著降低(P 0.01，P 0.05)。使用抗氧化剂 MitoQ 处理细胞，可以逆转 Pb2+暴露所诱导的细胞的OS、MDA 和 SOD1 水平变化(P 0.01)，且伴随细胞活力的显著回升。结论Pb2+暴露可能通过诱导 C17.2NSC 铜蓄积，促进氧化应激和细胞活力降低;抗氧化剂 MitoQ 可以抑制 Pb2+引起的氧化应激，起到显著的细胞保护作用。关键词 铅暴露;铜;神经干细胞;氧化应激 中图分类号 114 文献标志码 ALead-induced oxidative stress and copper overload in neural stem cells in vitro and theprotective effects of MitoQYAO Jinyu1，2，WANG Tao1，ZOU Yuankang1，ZHAO Ziyu1，2，GUAN uili1，ZHENG Gang11Ministry of Education Key Laboratory of Hazard Assessment and Control in Special Operational Environment，School ofMilitary Preventive Medicine，Air Force Medical University，Xian 710032，China;2Shaanxi University of ChineseMedicine，Xianyang 712046，China Abstract ObjectiveTo study the effects of lead ion(Pb2+)exposure on oxidative stress and copper overload inneural stem cells(NSC)，and to explore the antioxidative protection of MitoQ.MethodsC17.2 neural stem cells weretreated with 2.5，5，10，and 20 mol/L Pb(Ac)2for 24 h and 48 h，respectively，to establish a low-dose Pb2+exposuremodel in vitro，and the control group 0 mol/L Pb(Ac)2was set.Cell viability was detected by MTT assay.The contentof reactive oxygen species(OS)was measured by DCFH-DA fluorescent probe，and the content of malondialdehyde(MDA)was determined by TBA method.The activity of superoxide dismutase 1(SOD1)was determined by xanthineoxidase method.Copper absorption was detected by atomic absorption spectrophotometry.The protein levels of CT1，ATP7A and ATP7B were detected by Western blotting.esultsCompared with the control group，2.5 20 mol/L Pb2+exposure for 24 h or 48 h significantly inhibited cell viability，while the levels of OS and MDA and the activity of SOD1were significantly higher than those of the control group(P 0.01，P 0.05)After Pb2+exposure，the intracellularcopper level significantly increased(P 0.05)，CT1 protein level increased(P 0.05)，while ATP7A and ATP7Bprotein level significantly decreased(P 0.01，P 0.05)Treatment with antioxidant MitoQ could reverse the changes of612http:J Air Force Med UnivVol.44 No.32023OS，MDA and SOD1 induced by Pb2+(P 0.01)，with a significant increase in cell viability.ConclusionPb2+exposure may promote oxidative stress and decrease cell viability by inducing copper overload in C17.2 NSC.Theantioxidant MitoQ can protect the cells from oxidative stress induced by Pb2+exposure and promote the recovery of cellviability.Key words lead exposure;copper;neural stem cells;oxidative stress随着工业生产的发展，重金属铅(Pb)造成的环境污染严重威胁人群健康1。儿童是铅中毒的易感人群，由于其血脑屏障尚未发育完善等原因，其中枢神经系统更易受到铅暴露损伤。我国目前0 7 岁的儿童中，约有 8.6%的儿童血铅水平超过国际公认的血铅危险限值 50 g/L2。而且近年来研究表明，即使血铅低于 50 g/L3，也可引起儿童脑功能的损伤，表现为认知功能损伤、IQ 值降低等4 5。此外，铅暴露还可显著增加神经退行性疾病的发生风险。阐明铅诱导神经毒性的机制，寻找有效的预防手段，是公共卫生与预防医学面临的重要课题之一。在神经系统发育早期，神经干细胞(neural stemcells，NSC)的增殖与分化是正常的神经系统构建的基础。而在成年期的神经系统中，大脑室管膜下区等脑区的 NSC 增殖对于维持认知和记忆也十分重要。多项研究显示铅暴露可以影响 NSC 的增殖与分化6 7，但是其作用机制目前尚不清楚。本课题组以往研究发现铅暴露可以通过诱导神经细胞发生铜蓄积8;而细胞内铜水平的增高可促进氧化应激发生，造成过氧化损伤9。本研究拟通过进一步研究铅暴露诱导 NSC 铜蓄积、促进氧化应激的机制，并探讨线粒体靶向抗氧化剂 MitoQ 对于细胞的保护作用，为揭示铜元素代谢紊乱和氧化应激在铅神经毒性中的作用提供理论依据和研究基础。1材料与方法1.1材料DMEM 培 养 基、Trypsin-EDTA 和 青、链 霉 素(Gibco 公司，美国);胎牛血清(四季青公司，中国);醋酸铅、氯化铜、MTT 试剂(Sigma 公司，美国);活性氧(reactiveoxygenspecies，OS)、丙 二 醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)检测试剂盒(碧云天公司，中国)。MitoQ(MCE 公司，美国);组织细胞裂解液、上样缓冲液(碧云天公司，中国);BCA 蛋白定量试剂盒(Pierce 公 司，美 国);兔 抗(cooper transporter 1，CT1)、兔抗铜转运 ATP 酶 肽(Cu2+transportingATPase alpha polypeptide，ATP7A)、兔抗铜转运 ATP酶 肽(Cu2+transporting ATPase beta polypeptide，ATP7B)抗体(Thermo 公司，美国);羊抗兔、羊抗鼠二抗(康为世纪公司，中国);ECL 化学发光试剂(7sea-biotech 公司，中国)。Forma Series 型 CO2细胞培 养 箱(Thermo Fisher Scientific 公 司，美国);AAnalyst 800 原 子 吸 收 分 光 光 度 仪(Perkin Elmer，美国);FluorChem FC2 凝胶成像仪(Alpha Innotech 公司，美国);Infinite F200 型酶联免疫检测仪(Tecan公司，瑞士)。1.2方法1.2.1细胞培养与暴露模型建立小鼠神经干细胞系 C17.2 购自中国科学院上海细胞资源中心。使用含100 mL/L 胎牛血清、10 mL/L 青霉素和链霉素的DMEM 培养基，置于 37、50 mL/L CO2、饱和湿度的孵箱中体外培养，每 2 d 传代 1 次。培养至 2 3 代后，建立 Pb2+暴露细胞模型，主要步骤如下:接种细胞于 10 cm 培养皿或 96 孔培养板，使用含有不同浓度(2.5、5、10、20 mol/L)Pb(Ac)2培养液处理细胞24 h 或 48 h，并设置对照组 0 mol/L Pb(Ac)2。1.2.2细胞活力测定采用 MTT 法测定 Pb2+暴露对C17.2 细胞活力的影响。细胞 Pb2+暴露 24 h 或 48 h后，避光条件下每孔加入 5 g/L MTT 溶液 20 L，继续培养 4 h 后，各孔加入 150 L 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min 后，使用酶联免疫检测仪测定A490 nm值。1.2.3氧化应激相关指标检测Pb2+暴露完成后，收集各种细胞，分别用于测定 OS、MDA 水平及 SOD1活性。OS 水平测定采用