口腔黏膜脱落细胞数量对口腔癌风险指数预测准确性的影响_刘瑶.pdf

北京口腔医学 2023年第31卷第3期 Beijing Journal of Stomatology June 2023，Vol.31，No.3185脱落细胞学结合 DNA 含量分析是一种创伤小、操作简单的检查方法，该方法刷取口腔黏膜脱落细胞后，通过 Feulgen 染色和全自动细胞图像扫描，获得上皮细胞 DNA 指数（DI，DNA index），利用正常二倍体细胞与倍体异常细胞 DI 值的不同，成功应用于口腔癌的早期诊断1。文献报道，脱落细胞学结合 DNA 含量检测口腔癌和口腔白斑上皮异常增生的敏感性从 60%96%不等，特异性从79%96%不等2-8。本课题组前期运用口腔黏膜脱落细胞 DI 值建立口腔癌风险指数（oral cancer risk index，OCRI）模型，分层定量评估口腔白斑癌变风险，其诊断口腔癌的敏感性为 100%，特异性999，可较好地预测口腔白斑患者的预后，目前逐步开展应用于临床，长期随访的口腔白斑患者可以根据 OCRI 数值指导临床医师制订个性化疾病管理计划。脱落细胞学结合 DNA 定量分析首先需要将收集的每一个上皮细胞进行扫描，因此细胞数量的多少直接影响结果判读的准确性。研究表明，上口腔黏膜脱落细胞数量对口腔癌风险指数预测准确性的影响刘瑶 任爽 任倩 吕敏 付洁 王红健 孙正 关晓兵【摘要】目的 探讨不同口腔黏膜脱落细胞数量对预测口腔癌风险指数准确性的影响，为口腔黏膜脱落细胞检查刷取样本的标准提供依据。方法 纳入口腔白斑患者、口腔癌患者各 12 例，正常对照组 12 例，刷取病损或正常部位口腔黏膜脱落细胞，Feulgen 染色，获取 DNA 指数，随机抽取 500、1000、2000、4000、6000、8000、10000 个细胞，每例样本重复随机抽取 7 次，分别计算口腔癌风险指数。结果 正常对照组中，各组口腔癌风险指数均在 0.1 附近，无统计学差异。口腔白斑组中，有 8 例样本细胞数量对口腔癌风险指数结果没有影响，4 例样本出现轻度影响。12 例样本中 500 8000 个细胞数各组的口腔癌风险指数与 10000 个细胞数组比较，均无统计学差异。在口腔癌组中，细胞数量对口腔癌风险指数影响较大，具有显著统计学差异（P 0.01），其中4000、6000 及 8000 个细胞数组口腔癌风险指数与变异系数 10000 个细胞数组比较没有统计学差异。结论 口腔白斑伴异常增生样本，脱落细胞数量对口腔癌风险指数有一定影响。对于口腔癌样本，至少需要刷取 4000 个脱落细胞才能获得准确的口腔癌风险指数。【关键词】脱落细胞；口腔白斑病；口腔癌；口腔癌风险指数【中图号】R739.8【文献标识码】A【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2023.03.008Effect of the number of oral exfoliative cells on accuracy of oral cancer risk index LIU Yao,REN Shuang,REN Qian,LV Min,FU Jie,WANG Hong-jian,SUN Zheng,GUAN Xiao-bing.Department of Oral Medicine,Capital Medical University School of Stomatology,Beijing 100050,China【Abstract】Objective To investigate the effects of different numbers of oral exfoliative cells on the oral cancer risk index,and to establish the standard of the number of oral exfoliative cells.Methods Exfoliative cells were collected from oral mucosa of patients with oral leukoplakia(n=12),oral cancer(n=12)and normal subjects(n=12).The cells were stained by Feulgen and DNA index was collected.500,1000,2000,4000,6000,8000 and 10000 cells were randomly selected from each sample,and random sampling was repeated for seven times.Oral cancer risk index was calculated respectively.Results In normal subjects,the oral cancer risk index was close to 0.1.In 8 oral leukoplakia samples,there was no effect on oral cancer risk index for different number cells.In 4 samples,the number of cells had a certain effect on the oral cancer risk index.But there was no significant difference among all the cell numbers in the 12 samples.In oral cancer,the number of cells had a significant influence on oral cancer risk index(P 0.01).The oral cancer risk index and coefficient of variation of 4000,6000 and 8000 cells had no significant difference compared with 10000 cells.Conclusions In oral leukoplakia with epithelial dysplasia,the number of exfoliative cells had little influence.For oral cancer subjects,at least 4000 cells are needed to obtain an accurate oral cancer risk index.【Key words】Exfoliative cells;Oral leukoplakia;Oral cancer;Oral cancer risk index 基金项目：首都卫生发展科研专项（首发 2018-4-2141）作者单位：100050 北京 首都医科大学口腔医学院口腔黏膜科（刘瑶、任爽、任倩、付洁、王红健、孙正、关晓兵）；北京市疾病预防控制中心（吕敏）通信作者：关晓兵，E-mail：，电话：010-57099245北京口腔医学 2023年第31卷第3期 Beijing Journal of Stomatology June 2023，Vol.31，No.3186皮重度异常增生者因上皮萎缩导致刷取的脱落细胞数量少，脱落细胞学检查方法的敏感性可降低至 56%，甚至出现假阳性2，因此，刷取的脱落细胞数量不足，可降低脱落细胞学检查方法诊断的敏感性和特异性。本研究将通过检测正常对照人群、口腔白斑及口腔癌患者脱落细胞不同细胞数量对 OCRI 值的影响，初步建立刷取细胞数量的标准，并对 OCRI 预测口腔白斑癌变进行质量控制评估，以期进一步提高口腔黏膜脱落细胞口腔癌风险指数诊断准确性。资料和方法1.研究样本收集 2020 年 1 月至 2021 年 12 月于首都医科大学附属北京口腔医院黏膜科就诊的口腔白斑和口腔癌患者及正常对照人群。口腔白斑及口腔癌患者均经病理诊断证实，病理依据 2017 年版 WHO 组织病理学诊断标准。本研究经首都医科大学附属北京口腔医院伦理委员会批准（批件号：CMUSH-IRB-KJ-PJ-2019-09），所有受试者均签署知情同意书。本研究共分 3 组：口腔白斑组、口腔癌组、正常对照组,每组 12 例。口腔白斑及口腔癌组纳入标准：临床及组织病理学诊断符合口腔白斑及鳞状细胞癌的诊断标准；年龄 1885 岁；未经激光、放射线或化学药物治疗。排除标准：妊娠或哺乳期妇女；有严重心、肺、肝、肾等系统性疾患；患其他肿瘤或严重精神疾病患者。正常对照组纳入标准：口腔内无口腔白斑、口腔扁平苔藓、口腔红斑等口腔黏膜疾病及口腔鳞状细胞癌；年龄 1885 岁。排除标准：妊娠或哺乳期妇女；有严重心、肺、肝、肾等全身系统性疾病；患其他肿瘤或严重精神疾病患者。根据前期预实验数据，样本量计算公式：其中=0.05，=0.10，=0.1，计算得出每组需收集 12例样本，每例样本需测量 7 次。2.主要仪器与试剂细胞刷、保存液、细胞分散剂、Feulgen 染液、全自动细胞图像扫描仪（麦克奥迪实业集团有限公司，中国）。3.样本收集患者用清水漱口 30 s，口腔刷在病变部位，以中等力度，沿同一方向旋转刷拭 1015 下，放入保存液中（图 1A）。正常对照组受试者刷取口腔黏膜脱落细胞部位选择根据口腔白斑及口腔癌好发部位，随机刷取颊、牙龈、舌部位的口腔黏膜脱落细胞。4.Feulgen 染色及全自动细胞 DNA 定量分析系统扫描将消化后的细胞悬液离心，弃上清液后，加入适量细胞分散剂以减少细胞重叠，薄层液基制片，Feulgen 染色，全自动细胞图像扫描，获取每个上皮细胞核的积分光密度值，计算 DI 值（图 1B）。DI 值是以标本中的正常二倍体细胞作为内参，将被检测细胞的 DNA 积分光密度值与正常细胞的 DNA积分光密度值比较，正常细胞 DI 值为 1.00.1。DI值 2.50，则为异倍体细胞10。部位对收集的口腔黏膜脱落细胞 DI 值没有影响。中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞及细胞碎片等不参与诊断分析。图 1 口腔黏膜脱落细胞 DNA 含量分析 A：刷取口腔黏膜脱落细胞；B：细胞核图像及 DI 值 AB北京口腔医学 2023年第31卷第3期 Beijing Journal of Stomatology June 2023，Vol.31，No.3187 5.随机抽取不同数量的细胞临床刷取口腔黏膜脱落细胞数量从 500 10000个以上不等，每例样本随机抽取 500、1000、2000、4000、6000、8000、10000 个细胞，根据不同细胞数量分为7个亚组。每例样本需要重复随机抽取7次。6.计算口腔癌风险指数（OCRI）课题组前期利用口腔黏膜脱落细胞的 DI 值及R 语言，将不同 DI 值的细胞从小到大排序，通过统计建模、变量选择、交叉验证及统计模型评估，最终选择敏感性、特异性及曲线下面积均较高的随机森林分析方法计算出 OCRI，用于定量分层评估癌变风险9。OCRI 是未知样本患口腔癌的概率，范围从 0 到 1，接近 0 代表低癌变风险，接近 1 代表高癌变风险9。将口腔白斑组、口腔癌组及正常对照组重复随机抽取的不同数量（500、1000、2000、4000、6000、8000、10000 个）的细胞 DI 值分别带入 OCRI 计算模型中，计算得出各亚组 OCRI 值。7.统计分析采用 SPSS22.0 统计软件进行数据分析。将正常对照组、口腔白斑组、口腔癌组每例样本不同细胞数量的 OCRI 值进行平均，计算平均值和标准差。同时计算变异系数（coefficient of variation，CV）（标准差平均值）100%，CV 值可以进一步反映数据离散程度的绝对值。正常对照组、口腔白斑组、口腔癌组不同细胞数量对