金盏菊枯萎病病原鉴定及防治药剂筛选.pdf

h t t p：/bnxb cbp k do i：10.13473/k i.issn.1002-3186.2023.0207北京农学院学报 2023,38(2)：38-43 Jo u rnal o f Beijing Universit y o f Agricu l t u re金盏菊枯萎病病原鉴定及防治药剂筛选唐 冉，郭孜雪，陈莹莹，隆林芳，陈 艳*（北京农学院生物与资源环境学院/农村农业部华北都市农业重点实验室，北京102206）摘 要：【目的】为了明确金盏菊枯萎病的病原菌种类、筛选防治药剂。【方法】对分离得到的金盏菊枯萎病病 原菌进行了形态学和分子生物学鉴定，基于该病原菌的EF-la序列构建了系统发育树并对其致病性进行了测定。【结果】结果表明，引起金盏菊枯萎病的病原为尖抱镰刀菌刃t wn 通过生长速率法和盆栽法筛选了防治金盏菊枯萎病的药剂，结果表明，30%噁霉灵水剂和80%乙蒜素乳油对供试菌株F.oxysporum菌丝 生长的抑制活性最强，同时对于该类病原菌的盆栽防效最好，高达8&09%和82.14%0【结论】研究结果为金 盏菊枯萎病病原菌的鉴定及其田间防治提供了参考。关键词：金盏菊；枯萎病；病原鉴定；药剂防治中图分类号：S432.1 文章编号：1002-3186（2023）02-0038-06 文献标志码：APat h ogenic ident ific at ion and c ont rol of wilt disease on Calendula officinalisTANG Ran,GUO Zixu e,CHEN Yingying,LONG Linfang.CHEN Yan*(Key Labo rat o ry fo r No rt h ern Urban Agricu l t u re o f Agricu l t u re and Ru ral Affairs9 Co l l ege o f Bio science and Reso u rces Enviro nment,Beijing Universit y o f Agricu l t u re,Beijing 102206,Ch ina)Abst rac t:Cal e ndu l aofficinalis L.),an imp o rt ant medicinal and o rnament al p l ant,is gro wn widel y in Ch ina.In recent years wh o l e p l ant wil t ing p h eno meno n was o ft en o bserved in cal endu l a,wh ich cau sed l arge eco no mic l o ssesObject ive To ident ify t h e p at h o genic sp ecies o f cal endu l a wil t and screen t h e co nt ro l agent s 5 t h e t yp ical wil t samp l es were co l l ect ed in t h is exp eriment,and t h e diseased samp l es were iso l at ed and p u rified t o o bt ain t h ree fu ngal st rains.QMet h o ds Mo rp h o l o gical,mol ecu l ar and p at h o genicit y assays were p erfo rmed fo r t h ese p at h o gens?and t h e p h yl o genet ic t ree was co nst ru ct ed based o n EF-l a seq u ences.Resu l t sTh e resu l t s indicat ed t h at t h e et io l o gical agent cau sing Cal endu l a wil t disease was Fusarium oxysporum.Th e co nt ro l agent s against wil t were screened by gro wt h rat e and p o t t ing met h o ds,and t h e resu l t s sh o wed t h at 30%o xamycin p rimat e and 80%al l icin cream were effect ive against t h e t est ed st rain F.oxysporum wit h t h e h igh est inh ibit o ry act ivit y,wh il e p o t co nt ro l fo r t h e p at h o genic bact eria was t h e best,u p t o 8&09%and 82.14%.Co ncl u sio nTh e resu l t s wil l p ro vide an imp o rt ant t h eo ret ical basis fo r t h e et io l o gy o Cal endu l a wil t and it s fiel d co nt ro l.Keywords:Cal endu l a；wil t；p at h o gen ident ificat io n；ch emical co nt ro l金盏菊（C alendula officinalis L.）为菊科金盏 菊属植物，也称为山今菊、水涨菊金盏菊是一种 原产于南欧及地中海沿岸并在世界各地广泛栽培 的观赏和药用花卉植物，自引入中国后，全国各地 特别是南方地区广泛种植。金盏菊的花瓣中含有 包括黄酮和类胡萝卜素等多种活性化学成分，具 有广泛的生物活性。随着金盏菊在全球种植面积的扩大，病害发生收稿日期：2023-02-03基金项目：2018年度新型生产经营主体科技能力提升项目；人才培养质量建设-高水平人才交叉培养-实培计划（市级）（2021 00133）第一作者：唐冉（1998）,女，河北廊坊人，硕士，主要从事芳香植物病原鉴定及防治，Tel:18810108625；E-mail：1281005911q q.co m通信作者：陈艳（1972）,女，陕西西安人，副教授，博士，主要从事杀菌剂的开发与利用，Tel：13426045875；E-mail：ch enybu 2023年第2期唐冉等:金盏菊枯萎病病原鉴定及防治药剂筛选39率也逐渐上升。Do gra于1978年首先在印度发现 腐皮镰刀菌（F.solani）造成金盏菊枯萎病的现 象o Garibal di在意大利发现核盘菌Sclerotinia sclerotiorum）也会引起金盏菊枯萎病阪。2020年，Go mma在埃及贝尼斯威夫省发现金盏菊枯萎病,并分离出胶抱镰刀菌（F.subglutinans）和尖抱镰 刀菌（F.oxysporum.等镰刀属真菌，但并未做致病 性检测，故无法明确具体病原物。此外，在巴基斯 坦也报道了金盏菊枯萎病，但并未进行病原鉴定。同时，金盏菊还易受到病毒侵害，如鬼针草斑驳病 毒（TwCal）M、黄瓜花叶病毒（CMV）和双生病毒（To LCNDV）等。国内有调查发现金盏菊常发生灰 斑病、灰霉病、枯萎病和霜霉病危害*幻。这些病害 的发生对金盏菊产业造成了重创，制约了其产业链 的发展，但是对于金盏菊发生的病害及系统性研究 国内尚无报道。本研究采集了金盏菊枯萎病样品，对其进行了 病原物的分离、鉴定及致病性测定，并对该病原菌 进行了防治药剂的筛选。植物源农药来源于自然，其施用后易降解的特性对于金盏菊精油提取的影 响最低匚词。故也选用多种植物源农药并采用菌丝 生长速率法进行了药剂的初步筛选。研究结果为 金盏菊枯萎病病原菌鉴定及其防治提供数据支撑。1材料与方法1.1培养基和药剂实验采用PDA培养基。供试药剂：植物源类 药剂选用1%香芹酚水剂（AS）、1%蛇床子素水乳 剂（EW）和4%小糜碱水剂（AS）,购自内蒙古清源 保生物科技有限公司；80%乙蒜素乳油（EC）购自河 南比赛尔农业科技有限公司。化学药剂选用10%的苯瞇甲环哩水分散粒剂（WG）,购自江苏省先正 达南通作物保护有限公司；30%噁霉灵水剂（AS）,购 自江西禾益化工股份有限公司；22.5%噁瞠菌酮 30%霜氤水分散粒剂（WG）购自美国杜邦公司；25%毗瞠瞇菌酯乳油（EC）购自巴斯夫植物保护（江 苏）有限公司；5%亚胺哩可湿性粉剂（WP）购自北 兴化学工业柱式会社;23%松脂酸铜乳油（EC）购自 潍坊禾宜农化有限公司。分子生物学检测使用的 试剂购自百泰克生物科技有限公司（DNA提取试剂 盒）。1.2方法于2020年9月至2021年9月，在北京市延庆 区芳香植物产业基地大棚内采集金盏菊典型病害 样本,并记录其发病症状。1.2.1金盏菊枯萎病病原菌的分离及形态学鉴定 采用组织分离法，在发病的金盏菊茎基部及根部 的病健交界处切取大小为0.5 cmXO.5 cm的正方 形组织块，切取2030块组织，75%乙醇浸泡消毒 510 s,移入5%次氯酸钠30 s60 s,用灭菌的 ddH2O冲洗3次，最后用灭菌滤纸吸干水分后转到 PDA培养基中（26+2）C培养7 d。病原菌连续纯 化3次。对病原菌进行单抱分离。观察菌落形态并 挑取少量菌丝于光学显微镜下观察菌丝和抱子形 态。大型和小型分生抱子各随机选择30个测量其 长度与宽度，记录数据并进行鉴定。1.2.2 致病性测定 将分离出的病原菌在PDA 上，于（26士2）C培养10d。刮取培养好的菌丝到5 mL无菌水中，吸取无菌水反复冲洗吹打混匀，用3 层纱布过滤掉菌丝，离心10 000 r/min,去掉部分上 清液，配制浓度为1X10。个/mL的抱子悬浮液。取 生长状态一致的金盏菊幼苗（60日龄,高度为1017 cm），每个盆栽倒入30 mL抱子悬浮液进行接种处 理，黑暗24 h后转入光照培养箱（28 C,光暗各12 h,相对湿度60%）中继续培养14 d。试验设置3次 重复,每次处理接种3个植株，以无菌水作为空白对 照组，于3、5、7、10、14 d进行病程调查并记录。1.2.3 分子鉴定 病原菌经培养7 d后，利用 DNA提取试剂盒提取真菌DNA,用表1中引物进 行PCR扩增，引物均由北京六合华大有限公司合 成。PCR 反应体系 25 L：2X Easy-l o adTMPCR Mast er Mix 12.5”L、DNA 模板 2“L,引物各 1 ML表1金盏菊枯萎病病原菌所用引物名称及序列Tab.1 Name and seq uenc e of primers used for t h e pat h ogen of c alendula wilt基因 Gene 引物名称 Name o f p rimer 序列(5-3)Seq u ence(5-3)ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG核糖体DNA内转录间隔区ITSITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGCFOF1 ACATACCACTTGTTGCCTCG尖抱镰刀菌特异性引物FO1FORI CGCCAATCAATTTGAGGAACGEF-1 ATGGGTAAGGAGGACAAGAC翻译延伸因子EF-1 aEF-2 GGAGGTACCAGTCATCATGTT40北京农学院学报第38卷（10 ju mo l/mL）ddH2O&5 p cL0 94 C,60 s；94 C,60 s；56 C,30 s；72 C,60 s；30 个循环；72 C,10 min为PCR扩增程序。测得序列在