基于16S_rRNA基因测...黄褐斑病人肠道菌群差异研究_李琬晴.pdf

收稿日期 修回日期 基金项目 北京中医药科技发展资金项目（）；北京中医药大学东方医院“”工程项目（）作者单位 北京中医药大学东方医院 皮肤科，北京 作者简介 李琬晴（），女，硕士研究生通信作者 张丰川，博士，主任医师：文章编号（）临床医学基于 基因测序的黄褐斑病人肠道菌群差异研究李琬晴，蔡玲玲，郭丽媛，王 莹，刘思含，计 广，张丰川摘要目的：利用新一代 测序技术比较黄褐斑病人与健康人的肠道菌群多样性和细菌表型差异。方法：纳入 例黄褐斑病人为研究组，以 名正常人作为健康对照，测序分析粪便样品中细菌群落的结构组成和表型特征。结果：研究组肠道微生物群落丰度、多样性相对降低。研究组拟杆菌门、拟杆菌纲、拟杆菌目、普雷沃菌科、拟杆菌科、普雷沃氏菌、拟杆菌属等丰度显著降低，而厚壁菌门、放射菌门、放线菌纲、乳杆菌目、双歧杆菌目、毛螺菌科、布劳特氏菌等升高，差异均有统计学意义（）。结论：黄褐斑病人与健康人肠道菌群存在一定差异。关键词 黄褐斑；肠道菌群；核糖体；多样性；表型中图法分类号 文献标志码 ：，（，）：，：，（）：；黄褐斑是常见的难治性面部损容性皮肤病，对病人心理影响较大。据调查显示，患有色素代谢障碍的病人中同时患有抑郁症的比例高达。随着医疗卫生水平的提高，人们愈加关注损容性皮肤病，有关黄褐斑的实验及临床研究也越来越多，尽管如此，本病的机制及病因尚不明确，一般认为与紫外线照射、遗传因素、局部炎症反应、内分泌紊乱等密切相关。年 与 提出“肠 脑 皮肤轴”的概念以来，越来越多的研究提示皮肤疾病与肠道菌群的变化密不可分。皮肤和肠道表现呈生物学二态性，在构成免疫屏障方面具有类似的功能。目前多项研究发现皮肤病可引起肠道菌群的改变，而肠道菌群紊乱也可导致皮肤的变化，二者有相似的神经支配通路机信号转导系统。肠道菌群影响人体的免疫防御能力以及各类营养物质的新陈代谢，肠道菌群紊乱会导致免疫系统和机体内分泌的失衡，从而诱发皮肤色素代谢异常，因此，研究黄褐斑与肠道菌群的内在联系，也是探索本病病因与机制的新方向。资料与方法 一般资料纳入 年 月来北京中医药大学东方医院皮肤科门诊就诊的 例黄褐斑病人（研究组），以来本院体检中心进行常规体检的 名正常人作为对照组。所有研究对象近 周未用过微生物制剂（包括含乳酸菌的食品），近 周内未用过抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂等药物。排除合并胃肠道疾病或有消化系统疾病病史者；患有严重的内分泌疾病及代谢性疾病者；具有特定饮食习惯或饮食极不规律者。组性别、年龄（）（）均具有可比性，并签署知情同意书。粪便样品收集和 提取 收集 组人群的新鲜粪便样品置于无菌冻存管中，保存备 ，用。采用 对样本的基因组 进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测 的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至 。测序根据测序区域的选择，使用带 的特异引物，和高保真 聚合酶对选定 （上下游引物序列分别为 和 ）可变区进行 扩增。根据 产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用 浓度 的琼脂糖胶电泳纯化 产物，选择主带大小在 之间的序列，割胶回收目标条带。使用公 司 建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过 定量和文库检测，合格后，使用 进行上机测序。统计学方法采用独立样本 检验。利用物种丰度表，使用 语言绘制组间物种菌落组成柱状图。采用 语言执行 秩和检验来分析 多样性，并使用 绘制 图。此外，使用 秩检验对差异菌群的丰度进行相关性分析，探究肠道菌群与临床病情评分的潜在关联性。结果 样本测序数据分析 研究组与对照组 韦恩图分析：份粪便样品共得到 条序列，最终形成 个，研究组与对照组共有 个，研究组特有 个，对照组特有 个（见图）。肠道微生物 多样性分析 组的稀释曲线趋向平坦，表明所选定的测序深度可以满足研究需要，继续增加数据量只会导致很少数的新物种被检测到（见图）。多样性指标用于表征样品内的微生物群落多样性。反映群落丰富度的、和 指 数，以 及 反 映 群 落 多 样 性 的 和 指数，研究组均低于对照组，差异均有统计学意义（）。研究组比对照组的肠道菌群群落丰富度和多样性均发生了一定变化（）（见表）。表 多样性参数的比较分组研究组 对照组 示 值 肠道微生物 多样性分析 通过 分析提取数据中最主要的信息，即最能反映样品差异变化的信息，并绘制二维坐标图，横坐标（）与纵坐标（）分别代表影响群落组成的 组因素，百分比代表对样品差异的贡献值，各组样本分布有一定的集中趋势又存在一定的离散趋势（见图），说明不同组别之间是有差异的，存在自己独有的和不同的组间相似的肠道菌群结构，同一组内分离可能是影响个体肠道群落组成的因素较多。检验在门水平上，拟杆菌门（）在 黄 褐 斑 病 人 中 相 对 丰 度 较 低；厚 壁 菌 门（）、放射菌门（）在黄褐斑病人中相对丰度较高（见图）。在纲水平上，拟杆菌纲（）、厚壁菌纲（）在黄褐斑病人中相对丰度较低；芽孢杆菌纲（）、放线菌纲（）在黄褐斑病人中相对丰度较高（见图）。蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期 在目水平上，拟杆菌目（）在黄褐斑病人中相对丰度较低；乳杆菌目（）、双歧杆菌目（）在黄褐斑病人中相对丰度较高（见图）。在科水平上，普雷沃菌科（）、拟杆菌科（）在黄褐斑病人中相对丰度较低；毛 螺 菌 科（）、乳 杆 菌 科（）、双歧杆菌科（）在黄褐斑病人中相对丰度较高（见图）。在属水平上，普雷沃氏菌（）、拟杆菌属（）在黄褐斑病人中相对丰度较低；布劳特氏菌（）、乳酸杆菌属（）、双歧杆菌属（）在黄褐斑病人中相对丰度较高（见图）。讨论 本研究利用 测序方法对 例成年黄褐斑与 名成年健康对照组的肠道细菌群 基因 区进行测序分析，研究组与对照组共拥有 个相同，物种组成多样性分析结果显示，对于肠道微生物 多样性结果显示，研究组均低于对照组（），多样性指数显示 组样本肠道微生物群组成的多样性存在显著性差异；肠道微生物 多样性主坐标分析 图结果显示，除个别样本存在偏差，研究组和对照组基本呈现在不同区域，说明组间样本群落组成差异性较大，组内样本间群落组成更相似。，等通过对 人的粪便样本中的细菌种类以及其中 人的基因含量进行表征，研究了美国居民与其他两个国家的居民在细菌组合和功能基因库方面的差异性，结果显示尤其在婴儿早期和成年期细菌组合和功能基因库方面存在明显差异，不同国家的个体之间的微生物组存在显著差异。本研究因来就诊的黄褐斑病人中仅有极少部分为男性，且男性黄褐斑病人均未配合给予粪便样本，故本研究纳入的黄褐斑病人与健康对照组均为女性，年龄方面具有可比性。因婴幼儿与成人微生物群组具有差异性，故本研究只纳入成人样本；并且在样本采集中充分考虑了胃肠道疾病、消化道系统疾病病史、患有严重的内分泌疾病及代谢性疾病者、饮食习惯等因素，采取无菌冻存管收集样本，符合研究人源肠道微生物菌群的标本采集原则。本研究对 组样本进行菌群差异分析发现在各分类水平下差异有统计学意义，在门、纲、目、科、属、种分类水平下，均发现拟杆菌在黄褐斑病人中相对丰度较低，拟杆菌作为人类常驻菌群，是人肠道中一类丰度较高的肠道菌群，约占肠道微生物总数的，在人类肠道中有助于分解食物并产生身体所需的营养和能量，与人类具有共生关系，它们可以提供一定程度的保护，以免受侵入性病原体的侵害，而本研究显示拟杆菌在黄褐斑病人中相对丰度较低，可能受到一定病原体的侵害。年 提出“卫生假说”，即随着卫生水平的提高、人体对外界微生物暴露不足，导致多种过敏性疾病的发病率不断增高。该研究认为生命早期微生物的暴露不足使得免疫平衡倾向于 反应，使 反应异常激活，免疫特应性风险增加。随后“卫生假说”得到了“饮食 微生物”和“免疫偏差假说”理论的完善。这两种理论认为近些年来人类饮食倾向于肉类，减少了粗粮、蔬菜等富含高纤维食物的摄入，造成肠道菌群改变、破坏人体免疫稳态，其稳态是维持机体不受致病病原体感染的重要保护因素之一。普雷沃菌属主要产物是琥珀酸、乙酸等短链脂肪酸，其分解植物纤维的能力较强，而分解蛋白质及脂肪的能力较弱，膳食中的纤维可促进肠道中普雷沃菌丰度增加，高脂高蛋白饮食则降低肠道中普雷沃菌的丰度，因而饮食习惯偏向素食较多的人群的肠道中普雷沃菌属丰度相对较高。本研究发现普雷沃菌属在黄褐斑病人中相对丰度较低，提示可能与黄褐斑的发病有关。在目、科、属分类水平下，乳杆菌在黄褐斑病人中相对丰度较高，有研究发现，肠道中的乳杆菌对应激反应和抑郁症有益，等报道孤独症谱系障碍病人常出现胃肠道并发症，其胃肠道症状的严重程度与肠道内的双歧杆菌和乳杆菌等密切相关，另外，乳杆菌在结肠炎病小鼠中具有较高的丰度，说明乳杆菌可能维持了免疫的平衡。布劳特菌属于厚壁菌门，毛螺菌科，是健康人体肠道微生物群的重要成员之一。等发现，在乳腺癌病人中，高丰度的布劳特氏菌与不良预后具有相关性。本实验结果也发现了黄褐斑病人肠道菌群中布劳特氏菌的丰度明显增加，这可能为黄褐斑发病的潜在致病菌。本文基于 基因测序研究的黄褐斑病人肠道菌群差异存在一定的局限性，不足之处在于样本量相对较少，且未能在其他菌种水平下进一步分析肠道菌群与黄褐斑的关系，未来需要更先进的研究手段来揭示肠道菌群在黄褐斑疾病中的作用机制，探索黄褐斑与肠道菌群的内在联系。参考文献，（）：，（）：黄骏，许爱娥 黄褐斑发病机制研究进展 中国中西医结合皮肤性病学杂志，（）：，：王文霸，惠毅，朱珺 基于中医学“皮肠同病”与现代医学“肠 皮肤轴”理论探讨“皮病治肠”思路 中国中西医结合杂志，（）：郑敏玲 人体肘窝部皮肤菌群的多样性研究及其培养方法的探索 广州：广州中医药大学，于金蕾，朱振来，张月强，等 肠道菌群代谢产物 对特应性皮炎小鼠模型的作用 中国麻风皮肤病杂志，（）：徐思思 穴位埋线联合麦粒灸治疗女性黄褐斑的临床研究 广州：广州中医药大学，（）：王晨 肠道拟杆菌种结构组成对溃疡性结肠炎发展的影响 无锡：江南大学，（）：朱苏月，沈男，周永英，等 型手足口病的肠道菌群结构特征分析 徐州医科大学学报，（）：（下转第 页）蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期 ，（）：，：，（）：李新琳，吴艳飞，王丽丽，等 麻醉恢复室患者全麻苏醒期躁动的影响因素及与术后认知功能障碍的关系研究 现代生物医学进展，（）：中华医学会神经病学分会神经心理与行为神经病学学组 综合医院谵妄诊治中国专家共识（）中华老年医学杂志，（）：，：，（）：韩君，王君俏，王悦，等 岁及以上社区老年人身体衰弱与认知功能现状及相关性分析 复旦学报（医学版），（）：，（）：黄煦晨 衰弱评估与老年人行无痛胃肠镜检并发症发生率关系的观察研究 湛江：广东医科大学，（）：中华医学会麻醉学分会老年人麻醉学组 慢性阻塞性肺疾病患者非肺部手术麻醉及围手术期管理专家共识 中华医学杂志，（）：余革，温晓晖，张晓雪，等 慢性阻塞性肺部疾病病人麻醉机械通气时通气与血流比例的定量分析 国际麻醉学与复苏杂志，（）：，（）：，：，：，（）：周进国 不同 值对老年胃肠道手术患者 和 的影响及临床观察 唐山：华北理工大学，？，（）：，：（本文编辑 周洋）（上接第 页）姜涛，王雯磊，张明，等 普雷沃菌和饮食及糖代谢关系的研究进展 中华糖尿病杂志，（）：，（）：，：施长生，刘开才，吕维富，等 肝细胞性肝癌 后血清内毒素、样受体 和肠道生态改变的实验观察 蚌埠医学院学报，（），：，：，（）：李磊，徐志鹏，夏群，等醋酸钠林格液复苏联合乳酸菌对创伤失血性休克大鼠肠黏膜屏障的保护作用 蚌埠医学院学报，（）：李旻昊，袁梅，夏加增，等 腺苷抑制 活性对大鼠急危重症胰腺炎肠屏障功能障碍的影响 蚌埠医学院学报，（）：，（）：（本文编辑 刘璐）蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期