华蟾素注射液对胃癌细胞MGC-803增殖、迁移和侵袭能力及上皮-间质转化的影响.pdf

实验研究华蟾素注射液对胃癌细胞 增殖、迁移和侵袭能力及上皮间质转化的影响涂雅婷，王萌，程卉，李庆林，（安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 ；安徽中医药大学科研技术中心，安徽 合肥 ；新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 ）摘要 目的探究华蟾素（，）注射液对人胃癌细胞 增殖、迁移和侵袭能力以及上皮间质转化（，）的影响。方法 检测 注射液对 存活率的影响；倒置显微镜下观察 注射液对 形态的影响；采用细胞划痕实验和 小室检测 注射液对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响；检测人胃癌细胞 中 、和 蛋白表达水平。结果华蟾素注射液能显著抑制 细胞的增殖、迁移与侵袭（犘 ），且呈剂量依赖性。检测结果显示，注射液能显著上调 蛋白表达水平（犘 ），显著下调 、蛋白表达水平（犘 ）。结论华蟾素注射液可以抑制胃癌细胞 的增殖、迁移侵袭及 。关键词 华蟾素注射液；胃癌细胞；侵袭；转移；上皮间质转化 中图分类号 胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在全球恶性肿瘤中居于前位。目前，胃癌早期的主要治疗方法是胃切除、淋巴结清扫联合化学治疗或放射治疗，但由于胃癌早期诊断率极低，超过 的患者发现时已是晚期，而针对晚期胃癌的治疗方法主要是手术切除后结合传统药物辅助化学治疗或放射治疗，此时即使手术去除原发灶，预后仍不理想。此外，传统药物的发展遇到瓶颈，已很难进一步提高患者的生存质量。化学治疗造成无法避免的严重胃损伤，在很大程度上阻碍了其临床应用。因此，需要寻找更多对晚期胃癌转移患者有效的药物。胃癌的发生、发展、扩散及转移与其微环境密切相关。肿瘤微环境是指实体瘤所处的局部生物环境，包括癌细胞和附近的间质细胞。肿瘤或间质细胞分泌的可溶性因子在肿瘤微环境中含量丰富，有助于诱导肿瘤的异常增殖、血管生成、转移和耐药。肿 瘤 微 环 境 中 上 皮间 质 转 化（，）的发生与肿瘤细胞的迁移和侵袭密切相关，使静止的贴壁细胞获得迁移能力，是上皮细胞失去顶端基底极性和细胞细胞黏附，向侵袭性间质细胞转变的过程。胃癌 是 临 床 上 侵 袭 性 较 强 的 肿 瘤 之 一，因 此，基金项目：国家自然科学基金项目（，）作者简介：涂雅婷（），女，硕士研究生通信作者：李庆林（），男，博士，教授，阻断胃癌细胞的是治疗胃癌转移的关键。如何提高胃癌患者的临床获益是目前亟待解决的问题。中医药在肿瘤治疗方面有一定的特色和优势。蟾蜍分泌物蟾酥及其干燥的蟾皮均可入药。经现代中药成分分析，蟾酥及干蟾皮的化学成分主要有蟾蜍二烯羟酸内酯类、蟾毒色胺类及甾醇类化合物等。华蟾素（，）注射液是由干蟾皮通过水提醇沉的方法得到的水溶性提取物，已纳入国家基本医保目录作为抗肿瘤药物进入临床应用。临床应用 表明，对多种癌症均有明显的治疗作用。等 研究发现，可通过调节 轴抑制胃癌细胞增殖并促进凋亡。等 研究表明，抑制自噬可增强 诱导的胃癌细胞凋亡以起到抗肿瘤的作用。然而，抑制胃癌侵袭转移的机制并不明确。本研究拟探讨 注射液抑制胃癌细胞侵袭转移的分子机制，为 治疗胃癌提供理论依据。材料 细胞人胃腺癌细胞 购自中国科学院上海生命科学研究院。药物 注射液（批号 ）浓度为 ，由安徽华润金蟾药业股份有限公司提供，成分为干蟾皮提取物，辅料为 氯化钠。试剂 小室（货号 ，孔径）：美 国 公 司；胶（货 号 ）：公司；兔抗人 抗体（货号 ）、兔抗人 抗体（货号 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 ）：公 司；兔 抗 人 抗体（货 号 ）、兔 抗 人 抗 体（货 号 ）：成都正能生物技术有限责任公司；（货号 ）：江苏碧云天生物技术研究所；培 养 基、胎 牛 血 清（，）：美国 公司。仪器细胞培养箱、冰箱：日本 公司；倒置显微镜：日本 公司；超净工作台：浙江 苏 净 净 化 设 备 有 限 公 司；灭 菌 锅：日 本 公司；高速冷冻离心机：德国 ；垂直电泳仪：上海天能科技有限公司。方法 细胞的培养 细胞在含 和青霉素链霉素的 培养基中，于 、培养箱中培养，每用磷酸盐缓冲溶液清洗细胞，并换成新鲜的完全培养基，待细胞密度长至 时，胰酶消化，离心，按 的比例传代培养。检测 注射液对 细胞活力的影响取对数生长期的 细胞，按每孔 接种于 孔板中，每组个复孔，待细胞贴壁后，用细胞培养基稀释含 注射液的原液，分别给予细胞不同浓度（、）的 注射液（即为空白对照组），后每孔加入 溶液，后用酶标仪在 处检测吸光值。倒置显微镜下观察 注射液对 细胞形态的影响取对数生长期的 细胞，消化和收集，将细胞密度调整为每毫升，接种于含 培养基（含 和青霉素链霉素）的 培养瓶中，于 、培养箱中培养。待细胞贴壁后，更换为含有 注射液的培养基，继续培养 后，倒置显微镜下（倍）观察细胞并拍照。细胞划痕实验检测 注射液对胃癌细胞划痕愈合能力的影响将 细胞接种于孔板中（每孔），每组个复孔，待细胞贴壁后用枪头在每孔的培养瓶底部划横线后，洗去划下的细胞，给药后、在显微镜下观察细胞在划痕处的愈合情况。应用 软件分析愈合面积。划痕愈合率（划痕面积 划痕面积）划痕面积 。小室检测 注射液对胃癌细胞迁移能力的影响将 细胞接种于上室（放置在 孔板中，每孔），下层 孔板加入含 胎牛血清的 培养基。孵育 后，用多聚甲醛将下室细胞固定，结晶紫染色 后，用棉签轻轻擦拭小室内部未穿膜过的细胞，光学显微镜下拍照统计迁移细胞数量。细胞迁移率 注射液组细胞数 空白对照组细胞数 。小室检测 注射液对胃癌细胞侵袭能力的影响将 胶加入小室（放置在 孔板中）。处理 后每孔加入 个细胞，下层 孔板加入含 的 培养基。孵育 后，固定下室细胞，结晶紫染色 后，棉签擦拭掉小室内部未穿过的细胞，光学显微镜下拍照（倍），然后统计侵袭细胞数量。细胞侵袭率 注射液组细胞数空白对照组细胞数 。检测 注射液对人胃癌细胞 中 、和 表达水平的影响用含 的 裂解液将 细胞裂解。使用 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，每孔加 总蛋白。样品经 电泳分离，转移至 膜检测。用含脱脂牛奶的 室温封闭后，一抗孵育过夜。用 洗涤次后，在 标记的二抗（）中室温孵育。采用化学发光法检测抗原，使用 软件进行条带定量。统计学方法实验重复次并采用 等软件进行数据统计分析。数据结果采用“均数标准差（珚狓狊）”进行统计学描述。多组均数比较采用单因素方差分析。犘 表示差异有统计学意义。结果 注射液对 细胞活力的影响 注射液能抑制胃癌细胞 细胞的增殖活性，细胞存活率随着 注射液浓度的增加和时间的延长呈现下降趋势（犘 ），其中 注射液作用 后细胞存活率趋近 时存活率。因此，选择 注射液作用时间为 进行下一步研究。见图。注 射 液 对 细 胞 形 态 的 影响光学显微镜下观察发现，处理细胞 后，空白对照组细胞形态正常，贴壁良好，折光性强，而给予 注射液的各组细胞皱缩变圆，体积变小，细胞折光性明显变弱，贴壁较差，并且呈一定的剂量依 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 赖性。见图。注：与 空白对照组比较，犘 ；与 空白对照组比较，犘 图 注射液对 细胞存活率的影响（珚狓狊，狀）注射液对 细胞划痕愈合能力的影响与空白对照组比较，注射液各给药组细胞的划痕愈合变慢，并且呈现剂量依赖性（犘 ）。结果表明，注射液可以抑制 细胞的迁移能力。见图、表。注：空白对照组；注射液组；注射液组；注射液组图光学显微镜观察 注射液对 细胞形态的影响（倍）注射液对 细胞迁移和侵袭能力的影响与空白对照组比较，注射液可以显著抑制 细胞迁移率和侵袭率（犘 ），并且呈剂量依赖性，表明 注射液可抑制 的迁移和侵袭。见图、表。图光学显微镜下观察 注射液对 细胞划痕愈合能力的影响（倍）表各组 细胞划痕愈合率比较（珚狓狊）组别狀划痕愈合率空白对照 注射液 注射液 注射液 注：与空白对照组比较，犘 ；与 注射液组比较，犘 注射液对 细胞相关蛋白表达水平的影响与空白对照组比较，注射液能上调 细胞 蛋白的表达水平（犘 ），下调 、和 蛋白的表达水平（犘 ），且具有剂量依赖性。见图。表各组 细胞迁移率和侵袭率比较（珚狓狊）组别狀迁移率 侵袭率 空白对照 注射液 注射液 注射液 注：与空白对照组比较，犘 ；与 注射液组比较，犘 讨论尽管过去几十年来，针对胃癌的临床疗法在化学治疗和靶向治疗方面取得了重大进展，但转移仍 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 图 注射液对 细胞迁移和侵袭能力的影响（结晶紫染色，倍）注：空 白 对 照 组；组；组；组；与空白对照组比较，犘 ；与 注射液组比较，犘 ；与 注射液组比较，犘 图各组 细胞相关蛋白表达水平比较（珚狓狊，狀）然是胃癌患者有效治疗的关键障碍。寻找参与细胞迁移和侵袭的潜在分子机制有助于深入了解癌症转移。转移是引起胃癌患者死亡的重要原因。有研究 表明，在癌症进展和转移过程中起着关键作用。在过程中，上皮细胞失去其特征，重新编码基因表达并获得间质特性，这使得侵入性表型得以进化，并促进癌细胞的迁移。因此，一直被视为癌细胞侵袭行为的充分条件。近年来多项研究 表明，在胃癌的临床治疗中发挥作用。为了探究 抑制胃癌转移的分子机制，本研究首先通过 实验、划痕愈合实验以及 小室的细胞迁移与侵袭实验对药效进行验证，结果表明，注射液可以抑制胃癌细胞 的增殖、迁移与侵袭，且抑制效果呈剂量依赖性和时间依赖性。的共同特征是 表达的下调甚至缺失，伴随着 表达的上调。这种变化增加了肿瘤细胞侵入和转移到远端的能力。的表达促进肿瘤细胞从原位脱落，甚至克服了 的肿瘤抑制作用。是 转录 因 子 家 族 的 成 员，其 可 以 被 、等信号通路激活，从而抑制 ，诱导并促进细胞迁移。是一种重要的型中间丝蛋白，与其他细胞骨架成分（如微丝和微管）一起在细胞结构的支撑、附着、迁移和信号传导等动态过程中起重要作用。在癌症转移过程中，总是能观察到 的过表达，因此 被普遍认为是 的典型分子标志物。本研究通过 法探究 注射液抑制胃癌转移的分子机制是否与 有关。结果发现，注射液可以上调上皮标志蛋白 的表达水平，下调间充质标志蛋白 以及与 密切相关的 和 的表达水平，表明 注射液可以抑制胃癌细胞 的 。综上所述，注射液能明显抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与改善胃癌细胞的过程有关。但本研究仅从细胞层面进行了探究，对于 注射液体内抗胃癌的作用及分子机制仍需进一步研究。参考文献：，：，（）：，：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 （），（）：，（）：，（）：，：，（）：李宝晶，吴炎，王磊，等蟾皮中的蟾蜍甾烯类成分及其细胞毒活性研究中草药，（）：，：，（），（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：凌智君华蟾素胶囊联合化疗对晚期胃癌患者的影响临床研究，（）：，：，（）（），（）：，（）：，（）：（收稿日期：）犈 犳 犳 犲 犮 狋 狅 犳犆 犻 狀 狅 犫 狌 犳 犪 犵 犻 狀犐 狀 犼 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 狀 狋 犺 犲犘 狉 狅 犾 犻 犳 犲 狉 犪 狋 犻 狅 狀，犕 犻 犵 狉 犪 狋 犻 狅 狀，犪 狀 犱犐 狀 狏 犪 狊 犻 狅 狀犃 犫 犻 犾 犻 狋 犻 犲 狊 犪 狀 犱犈 狆 犻 狋 犺 犲 犾 犻 犪 犾 犕 犲 狊 犲 狀 犮 犺 狔 犿 犪 犾犜 狉 犪 狀 狊 犻 狋 犻 狅 狀狅 犳犌 犪 狊 狋 狉 犻 犮犆 犪 狀 犮 犲 狉犕犌 犆 犆 犲 犾 犾 狊 ，（，；，）犃 犫 狊 狋 狉 犪 犮 狋犗 犫 犼 犲 犮 狋 犻 狏 犲 （），（）犕 犲 狋 犺 狅 犱 狊 ；，犚 犲 狊 狌 犾 狋 狊 ，（犘 ），（犘 ）犆 狅 狀 犮 犾 狌 狊 犻 狅 狀 ，犓 犲 狔狑 狅 狉 犱 狊 ；：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月