梨小食心虫实时荧光PCR检测技术的建立与验证.pdf

保鲜与加工Storage and Process2023，23（0）：00-00加工研究梨小食心虫实时荧光PCR检测技术的建立与验证王凤军，周晓红（浙江经贸职业技术学院，浙江杭州310018）摘要：梨小食心虫（Grapholitha molesta）为我国常见蛀果性害虫，与其他梨果害虫的组织形态非常相似，仅凭形态学特征难以区分，需建立实时荧光PCR检测方法在基因水平上进行鉴定。通过样品核酸提取与质控，设计并验证荧光探针特异性，进一步通过优化反应条件和反应体系，结合特异性分析、灵敏性比对和盲样测试开发了梨小食心虫实时荧光定量PCR检测方法。结果表明：方法特异性强，重复性好（重复间变异系数为0.0550.359），可靠性高（标准曲线中的R2值为0.991），检出限低（最低检出限3 pg/L），盲样测试结果与形态学鉴定结果一致，能满足日常检验检疫需求。该操作方法简单易行，检测时限短（约3 h），通量高，特别适合于大批量的抽样检查，可应用于梨小食心虫的检疫工作。关键词：梨小食心虫；实时荧光定量PCR；快速鉴定Establishment and Validation of Real-Time Fluorescence QuantitativePCR for Identification of Grapholitha molestaWANG Feng-jun,ZHOU Xiao-hong（Zhejiang Institute of Economic and Trade,Hangzhou 310018,China）Abstract:Grapholitha molesta is a common internal fruit feeders from orchard in China,and is very similar to otherpear pests in the external morphology.It is difficult to distinguish only by morphological characteristics,a real-timefluorescent PCR detection method should be established for identification at the gene level.The specificity of fluorescent probe was designed and verified through sample nucleic acid extraction and quality control,and a real-time fluorescent quantitative PCR detection method for Grapholitha molesta was developed by further optimizing reaction conditions and reaction systems,combined with specificity analysis,sensitivity comparison and blind sample testing.The results showed that the method had strong specificity,good repeatability(the coefficient of variation between repeats was0.0550.359),high reliability(R2value of standard curve was 0.991),and low detection limit(the minimum detectionlimit was 3 pg/L),the results of blind sample test were consistent with morphological identification results,whichcould meet the needs of daily inspection and quarantine.This method is simple and easy to operate,with short detection time limit(about 3 h)and high flux,which is especially suitable for sampling inspection in large quantities,andcan be applied to the quarantine of Grapholitha molesta.Key words:Grapholitha molesta;real-time fluorescence quantitative PCR;quick identification中图分类号：S436.6DOI：10.3969/j.issn.1009-6221.2023.06.009文献标识码：A基金项目：浙江经贸职业技术学院省属高校基本科研业务费项目（20SBYB03）作者简介：王凤军（1984），女，汉族，硕士，高级实验师，研究方向：基因检测。60检测分析2023，23（6）：60-66保鲜与加工Storage and Process投稿平台：2023年第6期王凤军，等：梨小食心虫实时荧光PCR检测技术的建立与验证果业是农业产业化发展的重要环节，是各区域利用资源优势助推乡村振兴的重要举措。近几年，我国水果产业稳步发展，截至2021年，我国果园面积增长至1.3107hm2，水果年总产量持续增长，2020年高达2.9亿t1。为保证果品质量和国门安全，在果品进出口过程中需加强病虫害的检疫要求，尤其是对桔小实蝇、桃小食心虫、苹果蠹蛾等检疫性有害生物设置限制性检疫措施，以形成对外贸易障碍2-4。梨小食心虫是我国主要关注的鳞翅目多食性蛀果性害虫之一，目前我国仅西藏地区未见报道，其他的梨、桃产区均有发生。每年47月，梨小食心虫主要蛀食果树嫩梢，致新梢枯萎断落，7月开始蛀果，从果肩蛀至果心，形成“黑膏药”状，造成果实成熟前腐烂脱落，贮藏期烂果坏果，极大地降低了果实品质。梨小食心虫与其他蛀果性害虫常年混合发生，给梨、桃、苹果等水果的保鲜和加工行业带来巨大的危害和经济损失5。目前，依据形态特征较难对幼虫形态和虫体残骸进行准确可靠的鉴定6-7。母系单亲遗传的细胞色素C氧化酶亚基（CO）基因具有在种内较为保守、种间变异较大且重组率低、单拷贝、便于检测等特点，在各类昆虫的分子进化和种群结构中应用较广。实时荧光PCR技术是在常规PCR的基础上加入荧光染料进行实时监测扩增产物的核酸定量技术，具有特异性强、灵敏性高、准确性好等特点，广泛用于昆虫核苷酸多态性分析8-10、昆虫分类学11-12和昆虫生态学13-16等研究。王康等17对梨小食心虫和沙果小食心虫的细胞色素b基因部分区域进行测序，设计特异性引物，使用Sau3A1限制性内切酶，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法对这两个物种进行了多重检测。Ames等18利用CO基因片段上17个核苷酸的差异定位，使用限制酶对两种英国丽蝇进行鉴定。Barcenas等19在CO基因的两个保守区域中设计了正向和反向引物以扩增该基因的112116 bp片段，并经过实验室间的比对验证，建立了较为经济的常规定性PCR和实时荧光定量PCR检测方法，可用于苹果蠹蛾、东方果蛾等鳞翅目蛀果性昆虫的鉴定。本研究旨在解决日常检疫中形态学方法难以有效鉴定梨果幼虫和虫体残骸相关问题。通过设计种属特异性的PCR引物和荧光探针，经方法学验证建立了简易、精准和快速的实时荧光PCR检测技术，以期为梨小食心虫的早期监测和鉴定以及及时采取针对性的防治措施提供技术依据，具有重要的社会经济意义。1材料与方法1.1材料与设备1.1.1材料与试剂梨小食心虫（Grapholitha molesta）、苹果蠹蛾（Cydia pomonella L.）、香梨优斑螟（Euzophera pyriellaYang）的幼虫和成虫等样本均由乌鲁木齐海关提供。植物基因组DNA提取试剂盒（DP305），杭州天根科技有限公司；Taq DNA聚合酶、10PCR Buffer（含Mg2+）、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、琼脂糖、电泳缓冲液，北京全式金生物技术有限公司；2Taq PCRMasterMix （AQ711-01），南京诺唯赞生物科技公司；探针与引物委托上海生工合成。1.1.2仪器与设备ABI7500实时荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司；G:BOX EF2凝胶成像系统，英国Syngene公司；T100 PCR仪，美国Bio-rad公司；NanoDrop 2000C核酸蛋白分析仪，美国赛默飞世尔科技公司；TG16.5台式高速离心机，上海卢湘仪实验室仪器有限公司。1.2方法1.2.1核酸样本制备将收集到的梨小食心虫的幼虫、老熟幼虫、成虫、蛹、残骸和残体等生命周期各阶段的样本使用核酸提取试剂盒（DP305）提取总DNA。提取到的DNA经完整性、纯度和浓度测试，通过测试的DNA溶液保存于-20 备用。1.2.2CO特征序列定性PCR扩增及测序将采集新疆巴州不同地区果园的梨小食心虫成虫及幼虫样本，以 CO通用引物（正向引物：5-GGWGGATTTGGAAATTGAYTAGTWCC-3；反向引物：5-CCHGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3）经常规PCR扩增。扩增体系为：20 L的反应体系中，加入10 L的2Taq PCR MasterMix，上下游引物（10 mol/L）各1 L，待测DNA溶液2 L。在梯度PCR仪中运行，按照试剂盒说明书设置反应参数。扩增产物经测序得到梨小食心虫CO基因目的片段序列。1.2.3引物和荧光探针设计通过NCBI中的BLAST比对分析确定梨小食心虫CO特征序列的种内保守性和种间差异序列，在此基础上设计种属特异性的PCR引物和荧光探针。1.2.4实时荧光定量PCR反应实时荧光定量扩增体系为：10PCR Buffer（含Mg2+）2.5 L，dNTP（2.5 mol/L）2 L，上下游引物61保鲜与加工Storage and Process联系邮箱：2023年第6期（10 mol/L）各0.5 L，探针（10 mol/L）0.5 L，500 UTaq DNA聚合酶0.25 L和DNA模板4 L，补足反应体系至20 L。将PCR管置于实时荧光定量PCR仪中，设置扩增条件为：95 预处理 15 s，再以 95 变性 5 s，60 退火/延伸 60 s，进行 40 个循环。同时分别以已知梨小食心虫样本、已知苹果蠹蛾样本以及无菌蒸馏水为阳性对照、阴性对照和空白对照，所有样本设置3个生物学重复，每个反应进行3次技术重复。1.2.5特异性检测将通过形态学鉴定的梨小食心虫以及其他类似的鳞翅目昆虫的成虫和幼虫样本分别按照“1.2.1”的方法进行DNA提取，以通过形态学鉴定的梨小食心虫为阳性对照，以香梨优斑螟、苹果蠹蛾为阴性对照，以无菌蒸馏水为空白对照，以待测虫体作为待测样本，进行实时荧光PCR反应，反应条件及设置同“1.2.4”，验证梨小食心虫CO基因引物和探针的特异性。1.2.6灵敏性检测提取梨小食心虫DNA幼虫样本基因组DNA，以10倍浓度进行5次梯度稀释并进行实时荧光定量PCR反应，分别以DNA起始模板质量浓度的对数值为横坐标，以循环数为纵坐标绘制标准曲线，每个浓度设置3个生物学重复，每个反应进行3次技术重复。1.2.7盲样测试将上述所建立的荧光定量PCR检测体系应用于梨小食心虫的日常检测。项目组形态学专家制作了成虫和幼虫盲样，分别标记为盲1、盲2、盲3、盲4、盲5、盲6、盲7，使用本研究建立的引物探针和实时荧光定量PCR体系方法检测鉴定是否为梨小食心虫。1.2.8数据处理荧光定量PCR软件QuantStu