基于CRISPR_Cas9技术创建甜菜BvCENH3基因突变体的研究.pdf

北方农业学报 2023袁51渊2冤院员-员员JOURNAL OF NORTHERN AGRICULTURE韩平安，唐宽刚，常悦，等.基于 CRISPR/Cas9 技术创建甜菜 BvCENH3 基因突变体的研究 J.北方农业学报，2023，51（2）：员-11.DOI：10.12190/j.issn.2096-1197.2023.02.01收稿日期：2023-01-31基金项目：内蒙古自治区“揭榜挂帅”项目（2022JBGS0029）；国家糖料产业技术体系项目（CARS-170104）；国家自然科学基金项目（31860407）；内蒙古自治区“草原英才”创新人才团队项目（甜菜生物技术产业创新团队）；内蒙古农牧业创新基金项目（2022CXJJN09）作者简介：韩平安（1987），女，副研究员，博士，主要从事甜菜分子育种的研究工作。通信作者：吴新荣（1967），男，研究员，博士，主要从事甜菜分子育种的研究工作。李晓东（1977），男，研究员，博士，主要从事甜菜分子育种的研究工作。基于 CRISPR/Cas9 技术创建甜菜 BvCENH3 基因突变体的研究韩平安1，2，唐宽刚1，2，常悦1，2，孙瑞芬1，2，王良1，2，张自强1，2，付增娟1，2，赵尚敏1，2，吴新荣1，2，李晓东1，2（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特010031；2.内蒙古自治区甜菜品种遗传改良与种质创制重点实验室，内蒙古 呼和浩特010031）摘要：【目的】通过 CRISPR/Cas9 技术对甜菜 BvCENH3 基因进行编辑，建立甜菜高效基因组编辑技术体系。【方法】以 BvCENH3 为编辑目标，设计双靶标构建基因编辑载体，通过农杆菌侵染甜菜叶柄获得转基因植株，利用二代测序技术检测转基因植株突变情况，通过微滴数字 PCR 技术筛选低拷贝编辑植株。【结果】获得 82 株甜菜转基因植株，其中 40 株被成功编辑，编辑效率为 48.78%，靶标 1 效率优于靶标 2。突变类型有单碱基替换（T寅G、A寅C）、碱基缺失（TC、TCTC 缺失）等 5 种。筛选出 23 株低拷贝编辑植株，BvCENH3 插入拷贝数为 1.11.9。【结论】成功对甜菜BvCENH3 进行定点编辑，获得 40 株 BvCENH3 基因突变体。初步创建了甜菜基因组编辑技术体系，为甜菜单倍育种奠定了理论与技术基础。关键词：甜菜；BvCENH3；CRISPR/Cas9；基因组编辑；基因突变体中图分类号：S566.335.3文献标识码：A文章编号：2096-1197渊2023冤园2原园园园员原员员Research on the construction of sugar beet BvCENH3 gene mutants basedon CRISPR/Cas9 technologyHAN Ping忆an1袁2袁TANG Kuan忆gang1袁2袁CHANG Yue1袁2袁SUN Ruifen1袁2袁WANG Liang1袁2袁ZHANG Ziqiang1袁2袁FU Zengjuan1袁2袁ZHAO Shangmin1袁2袁WU Xinrong1袁2袁LI Xiaodong1袁2渊1.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences袁Hohhot010031袁China曰2.Inner Mongolia Key Laboratory of Sugar Beet Genetics and Germplasm Enhancement袁Hohhot010031袁China冤Abstract院揖Objective铱The CRISPR/Cas9 technology was used to edit the BvCENH3 gene in sugar beet aiming to establishan efficient genome editing system.揖Methods铱Taking sugar beet BvCENH3 gene as the editing target袁double candidatetargets were selected to construct gene editing vector.Transgenic sugar beet plants were produced through agrobacterium-mediated transformation.Next generation sequencing technology was utilized to identify the mutation types and dropletdigital PCR was employed to screen low-copy mutant plants.揖Results铱82 transgenic sugar beet plants were obtained袁40 ofwhich were successfully edited袁with an editing efficiency of 48.78%.Target 1 was more efficient than target 2.There werefive mutation types袁including single base substitution 渊T寅G尧A寅C冤 and base deletion 渊TC尧TCTC deletion冤.23 low-copyedited plants were selected袁with BvCENH3 insertion copy numbers ranging from 1.1 to 1.9.揖Conclusion铱Successfully editedBvCENH3 in sugar beet with 40 BvCENH3 gene mutants obtained.Preliminary established sugar beet genome editingsystem袁laying theoretical and technical foundations for sugar beet haploid breeding.Keywords院Sugar beet曰BvCENH3曰CRISPR/Cas9曰Genome editing曰Mutants食糖与粮、棉、油同属涉及国计民生的大宗农产品，它既是人民生活的必需品，也是我国农产品加工业，特别是食品和医药行业及下游产业的重要基础原料和国家重要的战略物资1。世界上约 35%的食糖来源于甜菜2，甜菜是我国两大糖料作物之一，是重要的特色经济作物。甜菜不仅是制糖业重要的基础原料，还是一种良好的饲料和潜在的能源作物3。甜菜为二年生异花授粉作物，采用常规育种方法获得纯合亲本的时间较长，育种速度缓慢，单倍体育种可以快速获得纯合体，获得的二倍体植株为纯合的双单倍体，大大缩短育种进程，提高育种效率。前期单倍体诱导技术主要为体外诱导4和体内诱导5。基于着丝粒特异性组蛋白基因 CENH3 的改造是近年来建立单倍体诱导系的一个研究热点。CENH3 是着丝粒特异的组蛋白 匀3 突变体，CENH3基因参与着丝粒复合蛋白的募集和稳定，在着丝粒的组装及染色体的正常分离与传递中起着关键作用6。因 CENH3 对着丝粒区域的重要性，CENH3 改变会导致染色体分离错误甚至产生致死效应7。拟南芥中 CENH3 低表达量抑制了有丝分裂，导致减数分裂时染色体的分离出现错误8。RAVI 等9通过对拟南芥染色体着丝粒的突变体研究，开发出了通过着丝粒介导使亲本之一染色体选择性丢失，从而获得单倍体的方法。该研究发现，拟南芥 CENH3-1 的无效突变体具有致死性。通过修饰来改变 CENH3可以挽救 CENH3-1 突变体的致死效应。一种是在CENH3的 N端融合绿色荧光蛋白，成为 GFP-CENH3；另一种是用组蛋白 H3.3 的 N 端代替 CENH3 的 N 端，并在 N 端融合 GFP，成为 GFP-CENH3 tailswap。将两种修饰的 CENH3 分别转入拟南芥 CENH3 致死突变体，转入后植株的野生表型均可恢复。通过转基因获得 GFP-CENH3 tailswap 纯合植株多数表现为雄性不育，作为母本与不同基因型的野生型植株杂交后能够产生 25%耀50%的父本单倍体，GFP-CENH3植株与野生型杂交，也能诱导单倍体，但频率低于GFP-CENH3tailswap 植株。玉米和芥菜用类似的方法修饰 CENH3，并将修饰后的 CENH3 转入 CENH3 纯合致死突变体，也能得到单倍体植株10-11。KARIMI-ASHTIYANI 等12研究表明，拟南芥 CENH3 的点突变就可以获得单倍体诱导系。CRISPR/Cas9 是一种重要基因组编辑工具，因CRISPR/Cas9 系统设计简洁、靶位点选择灵活、构建简单且编辑效率高，使其迅速成为植物基因组编辑主要工具13-15。CRISPR/Cas9 技术已成功在水稻16、小麦17、玉米18、棉花19等作物上得到了广泛的应用。利用基因组编辑手段，可以创造成单一亲本染色体消失的诱导系20-22。本研究以甜菜 BvCENH3 基因为目标基因，构建 CRISPR/Cas9 编辑载体，采用农杆菌介导法转化甜菜，对转基因植株进行初步分析，以期获得甜菜 BvCENH3 基因序列改变的突变体，同时通过进一步研究，建立可用于甜菜自交系培育的双单体生产体系，旨在为创建甜菜单倍体诱导系进而创制优良的甜菜新种质奠定理论基础并提供技术支撑。1材料和方法1.1试验材料甜菜（Beta vulgaris L.）无菌苗、载体 pBWA（V）K和 pBWA（V）-Cas9、EHA105 农杆菌菌株由内蒙古自治区农牧业科学院甜菜分子育种课题组保存。引物设计通过 Primer Premier 5.0 完成，序列由南京金斯瑞公司合成，相关信息见表 1。2北 方 农 业 学 报51 卷1.2试验方法1.2.1sgRNA 的设计与 CRISPR/Cas9 载体的构建以甜菜 BvCENH3 基因（LOC104907459）为目标序列，根据靶标设计的原则23设计 BvCENH3 基因的2 个 特 异 性 靶 标 序 列，靶 标 1 序 列：CCACCTGCTTGCTGCTGCTCCCC，靶 标 2 序 列：CCGCGCAGTTTGCAATCACCACA。同时设计扩增含2 个靶标序列的 sgRNA 引物（F1/R1 和 F2/R2，并引入 Eco31 玉酶切位点），序列见表 1。将靶标 1 通过 T4 连 接 酶 连 入 中 间 载 体 pBWA（V）-Cas9/BvCENH3-B1，靶 标 2 连 入 中 间 载 体 pBWD/BvCENH3-B2。用 Lgu 玉酶切 2 个中间载体 pBWA（V）-Cas9/BvCENH3-B1 和 pBWD/BvCENH3-B2，并用 T4 连接酶进行连接，获得含有双靶标的重组载体命名为 CRISPR-Cas9/BvCENH3。靶标反应条件，中间载体构建酶切连接反应体系、反应条件，双靶标载体构建酶切连接反应体系、反应条件均参照韩平安等24的方法进行。将双靶标重组载体 CRISPR-Cas9/BvCENH3 质粒转化大肠杆菌，待菌落出现后，用引物 F3/R3 进行 PCR 检测阳性克隆并测序。提取测序正确的阳性克隆质粒并采用冻融法导入农杆菌EHA105 中。用特异性引物 F3/R3 进行菌液 PCR 检测。PCR 检测体系（20 滋L）：2伊Mix 10 滋L，上游引物 1 滋L，下游引物 1 滋L，ddH2O 7 滋L，菌液 1 滋L。PCR 扩增程序：95 益 5 min；95 益 30 s，60 益 30 s，72 益 2 min，30 个循环；72 益 10 min；4 益保存。扩增