多巴胺分子印迹电极的制备及其应用于人体尿液中多巴胺的分析检测.pdf

收稿日期：2022-07-07基金项目：博士启动基金(No.28423299)作者简介：徐倩（2000-），女，学生，毕业于华北理工大学，研究方向：环境分析，；通讯联系人：赵硕，女，博士，讲师，研究方向：环境分析，。多巴胺分子印迹电极的制备及其应用于人体尿液中多巴胺的分析检测徐 倩，孙立震，王思淼，曹 萌，赵 硕（华北理工大学，河北 唐山 063000）摘要：以多巴胺（DA）为模板分子，吡咯为功能单体，构建特异性识别多巴胺的分子印迹电极，对所形成的分子印迹膜进行了表征。对缓冲溶液的pH值、洗脱剂的比例、洗脱时间、模板分子浓度等条件进行优化，最终在pH为6.2，洗脱剂甲醇水=31（V/V），洗脱时间3 min，模板分子浓度8 gmL-1条件下构建电化学传感器。此电化学传感器在多巴胺浓度为0.510 gmL-1范围内线性拟合良好，相关系数R2=0.990 59，检测限(LOD)为0.1 gmL-1。用于检测人体尿液中多巴胺的含量，检测过程样品无需洗脱，加标回收率为92.1%103.2%，相对标准偏差(RSD)小于3%。关键词：分子印迹技术；多巴胺；传感器；电聚合；检测doi：10.3969/j.issn.1008-553X.2023.02.009中图分类号：O657.1文献标识码：A文章编号：1008-553X（2023）02-0038-05安 徽 化 工ANHUI CHEMICAL INDUSTRYVol.49，No.2Apr.2023第49卷，第2期2023 年 4 月多巴胺(DA)作为儿茶酚胺神经递质，对中枢神经系统的生理功能有一定的调节作用，多巴胺的失调可能引起帕金森综合症、精神分裂症、注意力缺陷多动症和垂体肿瘤等疾病1-5。通过了解多巴胺如何调节大脑在控制身体运动方面的功能，可以确定一些重要的大脑相关疾病的治疗方法。此外体内多巴胺的分泌会产生上瘾的兴奋感觉，比如毒瘾、烟瘾就与多巴胺分泌有关。因此多巴胺的分析研究对神经生理机能、疾病诊断、毒品的检测等有重要意义。随着人们对多巴胺的研究不断深入，多巴胺检测的准确度和精密度都需要达到更高的要求6。目前已有紫外-分光光度法7、高效液相色谱法(HPLC)8、毛细管电泳法9、荧光光度法10、电化学分析法11等多种测定多巴胺的方法。由于多巴胺具有良好的氧化还原性能，而且电化学法与高效液相色谱法、毛细管电泳法、荧光光度法和分光光度法相比，分析速度快，灵敏度高，检测成本低，并且不易受杂质干扰，尤其是基于纳米材料的电化学传感器，在检测方面有助于提高多巴胺的选择性，近年来受到了越来越多的关注12。分子印迹技术(MIT)13是上世纪 70 年代 Wulff等14-16采用新的方法合成出的具有特异性识别能力的高分子，被称为分子印迹技术。该技术模拟天然抗原和抗体、酶和底物的特异性结合，制备出在功能位点和空间构型上与特定靶标完全匹配的分子印迹聚合物(Molecular Imprinting Polymers,MIPs)，适用于复杂基质样品中痕量级物质的预处理和分析。本研究采用电聚合法，以多巴胺为模板分子，吡咯为功能单体，在玻碳电极表面成功地聚合上了一层多巴胺的分子印迹聚合物膜，制备了多巴胺分子印迹电化学传感器，对目标分析物多巴胺进行分析检测。本传感器操作简便，在整个使用过程中无需样品的衍生化处理，无需样品的洗脱，而且响应速度快，选择性好，灵敏度高，可以满足对多巴胺的痕量分析要求，为珍贵生物样品中单细胞生物分析检测提供参考。1 实验部分1.1 试剂与仪器铁氰化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氧化铝，天津北 联 精 细 化 学 品 开 发 有 限 公 司；盐 酸 多 巴 胺（C8H11NO2HCl），上海麦克林生化科技有限公司；吡咯（C4H5N），上海柏卡化学技术有限公司；氢氧化钠、甲醇，天津永大化学试剂有限公司；蒸馏水，上海威立雅水处理设备有限公司。SK5210HP超声清洗仪，上海科导超声仪器有限公司；ST2100型pH 计，常州奥斯特仪器有限公司；CHI660E电化学工作站，玻碳电极（3 mm）、银/氯化银电 科研与开发 38极、铂电极，上海辰华仪器有限公司；Apreo 2C场发射扫描电镜，赛默飞。1.2 玻碳电极的预处理工作电极为玻碳电极，在使用前用粒径为0.3 m的氧化铝粉末在麂皮上进行抛光打磨，并分别在无水乙醇、蒸馏水中超声洗涤3次，洗涤后晾干。之后将经过预处理后电极在0.05 mol/L铁氰化钾溶液中进行循环伏安(CV)扫描至稳定，电位范围选择-0.20.8 V。1.3 电聚合制备分子印迹电极配置0.05 mol/L的吡咯溶液，支持电解质为磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH为7.4），随后配置成10 mg/mL的盐酸多巴胺溶液。将配置好的溶液通氮气除氧5 min。玻碳电极为工作电极，银/氯化银电极作参比电极，辅助电极选用铂电极，在不同的聚合时间内聚合，得到不同膜厚度的聚吡咯工作电极。之后优化条件，得到最优条件下的聚吡咯工作电极。电聚合结束后，将印迹电极用洗脱液洗脱，将DA从电极表面的印迹膜上洗脱下来，在电极表面上形成留有 DA 型空穴的分子印迹聚合物膜。非印迹分子电极的制备，除不加印迹分子DA外，其他制备条件不变。1.4 多巴胺分子印迹电极检测方法将三电极系统放入0.05 mol/L铁氰化钾溶液中，采用差分脉冲伏安法(DPV)（电位范围为-0.10.6 V，电位增量为0.004 V，振幅为0.05 V，脉冲宽度为0.05 s，脉冲周期为0.5 s），对印迹电极的电化学行为进行表征。通过比较裸电极和洗脱模板分子前后的峰电流变化判断分子印迹电极的性能。2 结果与讨论2.1 多巴胺分子印迹电极的制备三电极体系在聚合液中，经过循环伏安法（CV）聚合后，在玻碳电极表面形成一层分子印迹薄膜，如图1所示。由图1（a）可知，CV曲线中未见氧化还原峰，而玻碳裸电极（b）出现较为显著的氧化还原峰，表明裸电极表面没有聚合膜，铁氰化钾探针可以直接接触电极的表面，形成氧化还原峰。而电聚合过程可以在玻碳电极表面形成致密的吡咯聚合膜，阻挡了铁氰化钾探针接触电极表面，没有氧化还原行为，不会产生氧化还原峰。2.2 多巴胺分子印迹电极的形貌表征采用扫描电镜分别对分子印迹聚合物电极洗脱前和洗脱后进行表面形貌的表征，结果如图2所示。电聚合过程结束，在玻碳电极表面形成含有多巴胺分子的印迹膜，见图2（a），接着，经过洗脱，将多巴胺分子洗脱下来，在电极表面形成带有多巴胺分子空穴的印迹聚合膜，见图2（b）。在电极进行洗脱后，形成了具有DA印迹的特征性空穴。图2分子印迹电极洗脱前(a)和洗脱后(b)的扫描电镜图Fig.2 SEM images of molecularly imprinted electrode before(a)and after(b)elution2.3 多巴胺分子印迹电极的电化学表征为了研究分子印迹电极的电化学性能，采用差分脉冲伏安法(DPV)进行测试，如图3所示。图3裸电极的差分脉冲图(a)和分子印迹电极洗脱前后差分脉冲图(b)Fig.3 Differential pulse diagram of bare electrode(a)and differential pulse diagram of molecularly imprinted electrode before and after elution(b)由图3（a）可知，裸电极的峰电流较大，电极表面没有其他物质阻碍，铁氰化钾溶液可以与电极直接接触，发生氧化还原反应，故而峰电流较高。由图3（b）可知，未洗脱的分子印迹电极在铁氰化钾溶液中的电化学行为表征显示几乎没有峰电流，证明在工作电极表面形成图1分子印迹电极CV聚合后在K3Fe(CN)6溶液中的扫描图(a)和裸电极的CV扫描图(b)Fig.1Scanning diagram(a)of molecularly imprinted electrode in k3Fe(CN)6 solution after CV polymerization and CVscanning diagram of bare electrode(b)徐 倩，等：多巴胺分子印迹电极的制备及其应用于人体尿液中多巴胺的分析检测39总第 242 期 2023 年第 2 期（第 49 卷）安 徽 化 工了一种非导电致密的印迹膜，这层膜阻止了铁氰化钾探针与电极的接触；经洗脱后的分子印迹电极在铁氰化钾溶液中测试有峰电流产生，但是峰电流与裸电极相比较低，说明印迹聚合膜上有部分多巴胺(DA)分子已经被洗脱下来，形成具有特异识别多巴胺分子的空穴，铁氰化钾探针能透过空穴到达电极表面，产生响应电流。2.4 实验条件优化电聚合制备分子印迹电化学传感器的影响因素有很多，不同实验条件制得的传感器有不同传感效果，本实验对电聚合条件进行了优化。2.4.1 电聚合圈数的优化电聚合过程中，聚合圈数的选择影响分子印迹聚合膜的合成效果。如果选择的聚合圈数过少，则聚合时间短，可能会导致电极表面形成的聚合膜不均匀而不能正常使用；如果聚合圈数过多，则聚合时间过长，导致膜厚度增大，导电性减小，影响分子印迹电极的电化学性能。优化圈数选择6圈、12圈、18圈、24圈。实验条件除聚合圈数不同外，其他条件均一致。图4聚合不同圈数的印迹电极的差分脉冲曲线(a)和聚合圈数对峰电流的影响(b)Fig.4 Differential pulse curve of imprinted electrode polymerized with different circles(a)and the effect of polymerizationcircles on peak current(b)对电聚合不同圈数得到的分子印迹电极（洗脱后）进行电化学表征，得到的差分脉冲伏安曲线如图4（a），由图可知，聚合12圈洗脱后的分子印迹电极的峰电流最大，6圈的次之，根据三次平行实验数据，做出误差棒图，如图4（b）可知，聚合6圈，分子印迹电极（洗脱后）的电化学行为不稳定，实验结果峰电流误差较大，可能是该条件下，电聚合用的时间短，电聚合液中有部分多巴胺分子没来得及参与电聚合，聚合效果不理想，造成多次平行实验结果误差较大。随着聚合圈数的增多，膜的厚度不断增大，使得探针与电极接触的机会明显减少，因此峰电流会降低。后续条件优化实验电聚合圈数确定为12圈。2.4.2 pH值的优化多巴胺在碱性条件下久放容易自聚合形成黑色的聚多巴胺，电聚合液的pH也不宜过大，因此选取pH为6.0、6.2、6.8、7.0、7.6、8.2的磷酸盐（PBS）缓冲溶液分别进行实验，用差分脉冲伏安法（DPV）检测了洗脱模板分子后的印迹电极，对结果进行比较。如图5（a）所示，用pH 为6.2的PBS缓冲溶液做溶剂配制的电聚合液进行聚合效果最好，峰电流最大。由图4（b）可知，pH值为8.2的聚合液制备的印迹电极经洗脱后峰电流变小，效果不好，并且误差较大，原因可能是pH为8.2呈碱性，多巴胺分子在碱性的电聚合液中会自聚合形成黑色沉淀物，电聚合液部分变性，导致多次平行实验的结果误差较大。pH改变，峰电流变化较大，在弱酸性时峰电流较大，多巴胺更容易洗脱下来，形成具有特异识别功能的分子空穴。因此，选择 pH 为 6.2 的磷酸盐缓冲溶液（PBS缓冲溶液）配置的电聚合进行实验。图5不同pH值的差分脉冲曲线(a)和pH值对峰电流的影响(b)Fig.5 Differential pulse curve of different pH values(a)andthe effect of pH value on peak current(b)2.4.3 洗脱剂比例优化在电极表面形成多巴胺分子印迹聚合物膜后，模板分子（DA）容易被甲醇、乙腈等有机溶剂洗脱下来，本实验选用甲醇水溶液作为洗脱剂，考查了不同配比的洗脱剂对分子印迹电极的洗脱性能。选取甲醇和蒸馏水的体积比分别为0 1，3 1，4 1，5 1，6 1配制的5种洗脱液进行实验。图6不同洗脱比的差分脉冲曲线(a)和洗脱剂比例对