化学生物学实验“DNA片段...糖凝胶电泳检测”的改进研究_包婷.pdf

第 42 卷第 3 期2 0 2 2 年 9 月Vol.42，No.3Sept.2022化学传感器CHEMICAL SENSORS*通信联系人，何汉平,E-mail：;王升富,化学生物学实验“DNA 片段扩增和琼脂糖凝胶电泳检测”的改进研究包婷，熊成义，文为，张修华，何汉平*，王升富*（湖北大学化学化工学院，湖北武汉430062）摘 要：DNA 片段扩增和琼脂糖凝胶电泳检测是化学生物学的一个重要专业综合实验，旨在培养学生的综合实验技能并拓展科学思维。通常情况下，该实验利用聚合酶链式反应（PCR）进行 DNA 片段的扩增，但 PCR 仪器和试剂较为昂贵，大幅增加了实验成本。此外，PCR 操作的技术性较强，操作繁琐并涉及到多种微量试剂的移取，实验误差较大导致难以得到令人满意的实验结果。针对上述问题，该文提出利用杂交链式反应（HCR）代替 PCR 法进行 DNA 片段的扩增，该方法为无酶等温核酸扩增技术，简单、温和且不需要昂贵的设备。此外，通过指导学生进行 DNA 序列的设计，可以加深对 HCR 原理、碱基互补配对原则的理解和应用。基于 HCR 的 DNA 片段扩增避免了昂贵仪器和试剂的使用，降低了实验成本，简化了实验操作，提高了实验的成功率。关键词：DNA 扩增；聚合酶链式反应；杂交链式反应；琼脂糖凝胶电泳；实验改进Research on Improvement of Chemical Biology Experiment Amplification of DNA Fragments and Agarose Gel Electrophoresis Detection Bao Ting,Xiong Cheng-yi,Wen Wei,Zhang Xiu-hua,He Han-ping*,Wang Sheng-fu*(College of Chemistry and Chemical Engineering，Hubei University,Wuhan 430062,China)Abstract:Amplification of DNA fragments and agarose gel electrophoresis detection is an important professional comprehensive experiment in chemical biology,which aims to cultivate the comprehensive experimental skills and expand scientific cogitation of students.Usually,this experiment utilizes polymerase chain reaction(PCR)to amplify DNA fragments,however,the instrument and reagents of PCR are relatively expensive,which greatly increases the experimental cost.In addition,the PCR operation is relatively highly technical,the operation is cumbersome and involved in the pipetting of a variety of trace reagents.Therefore,the large experimental error makes it difficult to obtain satisfactory experimental results.In view of the above problems,this paper proposes to use hybridization chain reaction(HCR)instead of PCR to amplify DNA fragments.This method is an enzyme-free isothermal nucleic acid amplification technology,which is simple,mild and does not require expensive equipment.In addition,students can deepen their understanding and application of the principle of HCR and base pairing by guiding them to design DNA sequences.HCR-based DNA fragment amplification avoids the use of expensive instruments and reagents,reduces the experimental cost,simplifies the experimental operation,and improves the success rate of the experiment.Key words:Nucleic acid amplification;Polymerase chain reaction;Hybridization chain reaction;Agarose gel electrophoresis;Experimental improvement包婷等：化学生物学实验“DNA 片段扩增和琼脂糖凝胶电泳检测”的改进研究533 期0 引言化学生物学是一门化学和生物学、医学、药学等交叉融合的学科，主要利用化学方法对生命体系进行研究，旨在从分子层次揭示和阐明生命过程1。其中，化学生物学专业综合实验是该学科的重要组成部分，相较于基础实验而言，具有实验周期长、实验设备复杂、操作步骤繁琐和技术性较强等特点。开展化学生物学综合实验不仅有利于学生实验操作技能的锻炼，而且对于学生科学思维能力的提升和科学素养的拓展大有裨益2,3。“DNA 片段扩增和琼脂糖凝胶电泳检测”是化学生物学一个重要的专业综合实验，包括 DNA 片段的扩增和扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测两部分。实验目的是使学生了解核酸体外扩增技术和琼脂糖凝胶电泳的原理，掌握核酸扩增仪、凝胶电泳仪和凝胶成像系统的使用方法。因此，本实验对于学生了解核酸体外扩增的前沿技术、掌握核酸的分离和鉴定方法具有重要意义。目前，该实验主要利用聚合酶链式反应（PCR）进行 DNA 片段的扩增。PCR 是一种经典的核酸扩增技术，通过一个寡核苷酸引物与模板 DNA 配对，在 DNA 聚合酶和核苷酸存在下，通过高温变性-低温退火-适温延伸三个过程的反复进行，实现 DNA 片段的指数级扩增4,5。PCR 技术具有反应效率高、特异型好、可自动化等优点，在疾病诊断和生物医药等领域备受关注6。尽管 PCR 技术已经较为成熟，但其仪器和试剂较为昂贵，大幅增加了实验成本。此外，PCR 操作的技术性和复杂性较强，并涉及到多种微量试剂（引物、模板 DNA、核苷酸、DNA 聚合酶、缓冲溶液和去离子水）的移取，学生在进行该实验时，实验误差较大，往往难以得到令人满意的 PCR 和凝胶电泳实验结果。因此，在 DNA 片段的扩增这部分实验中，使用简单、温和、低成本的核酸扩增技术代替PCR 实现 DNA 片段的扩增，有利于提高实验成功率并降低实验成本。基于此，我们提出了利用杂交链式反应（HCR）这种简单的无酶等温核酸扩增技术进行 DNA 片段的扩增。1 HCR 扩增原理近年来，无酶等温核酸扩增技术受到了广泛的关注，其反应过程在无酶恒温的条件下进行，通过特定引物的加入实现核酸的扩增。常见的无酶等温核酸扩增方法有 HCR、链置换反应（SDR）、催化发夹自组装（CHA）等，这些方法无需专用设备和酶的参与，具有简单、温和、高效等优点7-9。其中，HCR 是由 Dirks 和Pierce等人于2004年提出的一种核酸扩增方法，其主要过程为在靶标 DNA 的存在下，由两个发夹 DNA 交替组装形成长双链 DNA10。如图 1 所示，当靶标 DNA 不存在时，两条发夹 DNA（H1、H2）保持结构稳定（步骤 a）；当加入靶标 I 后，I 首先与 H1 杂交形成 IH1 双链 DNA（步骤 b）；随后，IH1 双链中剩余的 H1 序列充当立足点，诱导 H2 组装形成 IH1H2，剩余的 H2 序列作为立足点，诱导 H1 的组装，随着 H1 与 H2 级联自组装的进行，最终导致了长双链 DNA 结构的形成，实现 DNA 扩增（步骤 c）。HCR 反应具有反应条件温和、组装效率高、放大效果好的优势，被广泛用于生物医学、环境监测和食品安全等领域。图 1 HCR 过程中两条发夹 DNA 组装原理Fig.1 Principles of two hairpins assembly in HCR process42 卷54化 学 传 感 器2 实验仪器与试剂实验仪器：DYCP-32C 型琼脂糖电泳仪、Gel Doc XR+凝胶成像分析仪、烘箱、微波炉实验试剂：DNA（HIV-DNA、H1、H2）、DNA marker（100-200 bp）、琼 脂 糖、Gel-Red、20 mmol/L Tris-HCl（100 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，pH 7.4）、50TAE 缓冲溶液（2 mol/L Tris-acetate,50 mmol/L EDTA，pH 8.5）、6DNA loading buffer（0.05%溴酚蓝、36%甘油、30 mmol/L EDTA、0.05%二甲苯氰）3 DNA 序列的选择与设计HCR 的靶标 DNA 可以根据实验需要灵活选择，如艾滋病病毒 DNA（HIV DNA）、乙肝病毒 DNA（HBV DNA）、大肠杆菌 DNA（E.coli DNA）等，还可以选择 micro RNA（miRNA）作 为 靶 标，如 miRNA-21、外 泌 体 miRNA、miRNA-205、等。因此，通过不同靶标的选择，可以引导学生进行两个发夹 DNA（H1 和 H2）的序列设计，有助于学生对于碱基互补配对原则的理解和应用，还可以更加深入地了解基于HCR 的 DNA 扩增原理。例如，以 HIV DNA 作为靶标序列11，进行H1 和 H2 的设计，序列如下：HIV DNA：5-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3；H1：5 -CTAGAGCCGTCGAACTTTTCC-ATGTGGAAAATCTCTAGCAGT-3；H2：5 -GGAAAAGTTCGACGGCTCTAG-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3。H1 和 H2 序列中的下划线为形成发夹结构的互补配对部分。将三种 DNA 分别溶于 20 mmol/L Tris-HCl 缓冲溶液中，置于 4 储存。使用前，H1 和 H2 分别加热至 90 维持 10 min，缓慢冷却至室温形成发夹结构。4 实验步骤（1）HCR 过程：将 20 L 1 mol/L HIV DNA、20 L 2 mol/L H1 和 20 L 2 mol/L H2 混合，在 37 培养 1.5 h，完成 HIV DNA 触发的 HCR 过程。（2）琼脂糖凝胶的制备：将 2 g 琼脂糖溶于 100 mL TAE 缓冲液（pH 8.5）中，用微波炉加热制备 2%琼脂糖凝胶溶液，冷却至 50 后，加入 10 L Gel-Red 并混合均匀。将上述凝胶倒入洁净制胶槽中，插入梳子。当凝胶全部凝固后，垂直拔出梳子，将凝胶转移至电泳槽中，加入 1TAE 缓冲液（pH 8.5）至没过凝胶 1 mm。（3）加样：向第一个加样孔中加入 10 L DNA marker（25-500 bp），接 着 将 H1、H2、HCR 产物中加入 5 L 1DNA loadi