动物源医疗器械可沥滤物的研究进展.pdf

2 2 4CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS综述癌变畸变突变Vol.35No.3May 2023动物源医疗器械可沥滤物的研究进展刘璟1，2，刘子琪1，2，丁黎2，付步芳1，*(1中国食品药品检定研究院，北京102629；2中国药科大学，江苏南京211198)收稿日期：2023-03-11；修订日期：2023-04-27基金项目：国家重点研发计划(2017YFC1105000)作者信息：刘璟，E-mail：。*通信作者，付步芳，E-mail：【摘要】动物源医疗器械作为应用广泛的医疗器械产品，应不断完善其评价技术和方法，提升质量评价标准，以促进产业的健康发展。临床使用过程中，动物源医疗器械产品产生的可沥滤物会不同程度地对人体产生危害。因此，总结概括动物源医疗器械可沥滤物的研究进展，对于动物源医疗器械产品质量控制具有重要意义。本文介绍了动物源医疗器械可沥滤物的监管现状，对不同来源的可沥滤物进行了分类分析，并总结概括了相关浸提液的制备方法、可沥滤物的检测方法、可沥滤物允许限量的确定方法。最后，对动物源医疗器械领域的研究和质量评价现状进行了概括和展望。【关键词】动物源医疗器械；可沥滤物；检测方法；质量评价中图分类号：R318.08文献标志码：A文章编号：1004-616X(2023)03-0224-04doi：10.3969/j.issn.1004-616x.2023.03.012动物源医疗器械产品指全部或部分采用动物组织制成的，或取材于动物组织、动物组织衍生物或由动物体自然获取物质制成的医疗器械产品。与非动物来源的材料相比，具有更好的生物相容性和生物活性等特点1，使得应用领域越来越广泛，原材料的种类也越来越多。根据国家食品药品监督管理局2017年发布的医疗器械产品分类目录，动物源医疗器械产品主要有5类，包括无源植入器械，如人工骨、心脏瓣膜、外科修复补片等；无源手术器械如胶原蛋白缝合线、羊肠缝合线；护理和防护器械，如胶原蛋白海绵、壳聚糖防黏连膜等；眼科器械，如脱细胞角膜植片、眼用透明质酸钠等；口腔科器械如生物膜、口腔修复膜等。应用动物源医疗器械受益的同时也面临着两大风险：动物源材料特殊的免疫毒性风险和供体本身所携带的病毒等危险性因子及其外源因子污染引起的安全风险问题1。为有效降低动物组织带来的免疫原性，动物源产品一般需要进行脱细胞、去除杂蛋白等工序。异种产品相对非生物源产品更重视病原体带来的传播风险，需要进行严格的病毒灭活、灭菌处理。包括以上工序在内的多种加工过程中产生的加工工艺残留、灭菌残留剂等物质存在一定毒副作用，同时在医疗器械的应用中，这些物质均可能直接或通过相关介质进入人体2-3。上述医疗器械或材料在临床使用过程中释放出的物质统称为可沥滤物。动物源产品可沥滤物的研究为相关产品的生物学评价和毒理学风险评估提供所必需的信息，并为产品开发及优化提供支持。因此，对医疗器械的可沥滤物研究既是企业在设计开发产品阶段的研究热点，也是当下医疗器械监管和相关产品技术审评关注的重点4-5。1动物源医疗器械可沥滤物的监管现状经国家药监局医疗器械标准管理中心网站查询，动物源医疗器械产品现行有效的相关标准有9项，见表1(序号19)，与可沥滤物相关的标准有3项，见表1(序号1012)，迄今为止尚无关于动物源医疗器械可沥滤物具体检测方法的国家标准或行业标准。国家药监局医疗器械技术审评中心先后发布医疗器械已知可沥滤物测定方法验证及确认注册技术审查指导原则及医疗器械未知可沥滤物评价方法建立及表征技术审查指导原则(征求意见稿)后，对医疗器械的可沥滤物检测和评价要求正式作为必需的注册申报资料，大多数包括动物源在内的医疗器械均需要进行可沥滤物的控制。但目前可沥滤物的检测分析和评价方法较少，因此有必要探索建立一套科学规范的医疗器械可沥滤物的标准化检测分析方法。2动物源医疗器械可沥滤物的种类动物源产品来源丰富，取材范围广泛、制备过程复杂、使用到有机溶剂等小分子物质种类较多，因此，形成可沥滤物的安全性风险更高。确定动物源医疗器械可沥滤物种类是建立可沥滤物检测分析方法的基础，常见的可沥滤物来源主要有以下几个方面。2.1脱细胞为降低动物源材料在生产加工过程中可能出现残留的组织蛋白、抗原等物质带来的免疫原性风险，一般会采取脱细胞、去除杂蛋白等方法6。其中，天然组织材料经过脱细胞处理后，能够显著降低移植后排斥反应的发生，同时保留原有的组织结构和特性，材料表面微环境依然有利于细胞的生存。目前综述癌变畸变突变2 2 5CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS2023 年 5 月第 35 卷第 3 期常用物理、化学和生物酶法等进行脱细胞处理。在组织工程心脏瓣膜去除细胞的方法主要有：胰蛋白酶法、去垢剂-酶消化法、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)法和去氧胆酸钠法等7-10。常用试剂如SDS可通过溶解细胞质和核膜，破坏蛋白质分子内和分子间相互作用导致细胞死亡，但SDS作为表面活性剂，当其到达一定浓度会产生细胞毒性和溶血作用，因此需对其残留量进行严格限制11-12。周建伟等13研究了SDS的残留量与细胞毒性的相关性，并得到对L-929细胞和MC3T3-E1细胞产生细胞毒性的临界浓度分别为410-3mg/mL和610-3mg/mL。2.2交联改性为提高动物心脏瓣膜的稳定性，显著降低免疫原性，提高使 用 寿 命，早 在 1968 年 Carpentier 就 使 用 戊 二 醛(glutaricdialdehyde，GA)交联处理异种生物组织瓣，1970年开始，GA交联的牛心包材料制备的生物瓣膜已得到了推广14。目前探索的天然交联剂有去甲二氢愈创木酸、单宁酸等，化学试剂有碳化二亚胺等。因为GA具有水溶性、价格便宜等优点，其为最先使用并且最常用的交联剂15。汪希铭等16将壳聚糖基纳米纤维膜经GA交联处理后，稳定性得到明显改善，并且一定程度上提升了纤维膜强度和韧性。此外目前对脱细胞真皮基质等产品也常用GA进行交联改性。然而，GA具有较强的细胞毒性，GA交联制备的生物瓣因GA缓慢而微量的释出仍可引起细胞毒性，此外，生物瓣在体内的钙化也与GA交联有关17。因此在实际应用中，醛类交联产品可以根据所需的性能来选择最优的交联剂用量，并需要对醛残留量进行严格控制和检测。2.3病毒灭活及灭菌动物病原感染人早已引起社会各界的关注，禽流感、狂犬病等给人类带来不同程度的危害。动物源产品来源于动物的骨、皮肤、肌腱等组织，因此需要格外重视病毒灭活和灭菌工序，除需要满足 YY/T 0771动物源医疗器械等标准要求外，还要重视保护生产操作人员和环境以免造成污染18。常见工艺中，如环氧乙烷灭活法在骨材料中的应用，但现在应用较少；过氧乙酸-乙醇灭活法在皮肤、骨等材料中均有较好的应用；此外，过氧化氢灭活法也被广泛应用于骨、胶原材料中。研究发现19-20对牛腱片样品经3%过氧化氢溶液处理后，水疱性口炎病毒、甲型H1N1病毒的灭活对数值均大于4，马来源的皮质骨和松质骨颗粒及心包膜材料经3%过氧化氢溶液处理后的所有生物材料均表现出完全消除病毒感染性，单纯疱疹病毒、甲型H1N1病毒和柯萨奇病毒灭活对数值均大于4，即表明过氧化氢灭活病毒后的产品质量安全可靠。但病毒灭活的同时会对生物材料性能造成不同程度的损害，白玉龙等19研究表明过氧乙酸、过氧化氢、环氧乙烷等残留也会对人体产生危害，甚至会引起致癌、致畸。动物源产品及其原材料在贮存、生产及使用等过程中产生的各种化学物质的反应产物等也需要被考虑，如2-氯乙醇为环氧乙烷灭菌过程中衍生的有机物质。经环氧乙烷灭菌的产品可能仍残留一定量2-氯乙醇20。对于绝大多数国内医疗器械产品的注册检验，2-氯乙醇仍是非强制性检测项目，但已有广泛的研究表明2-氯乙醇的检测需要被重视21。3动物源医疗器械浸提液的制备方法可沥滤物的分析方法一般包括浸提液制备和可沥滤物的检测方法两部分。大部分动物源器械特别是长期植入类器械，很难获得临床实际使用时的研究数据，所以很多情况下可选择浸提方式制备浸提液，从而完成对可沥滤物的研究。由于动物源医疗器械种类繁多，因此用于可沥滤物检测的浸提液制备方法也各有不同。浸提液制备的研究主要包括：浸提介质的选择，样品浸提部位的选择，浸提方式的选择，浸提条件的选择。3.1浸提方式与浸提样品的选择常用的浸提方式包括加速浸提、模拟浸提、极限浸提和加严浸提，极限浸提可建立从医疗器械或材料中浸提的最大可浸提物的量，即医疗器械或材料在临床使用寿命期间可能释放的可沥滤物量的最大量。动物源医疗器械属于持久接触或长期接触类器械，很难模拟实际使用条件，所以一般选择极限浸提。此外，可根据实际情况选择除浸提外的其他方式，如李丽花等22研究中由于正己烷不溶于水，而采用无机酸溶液进行样品前处理后再用静态顶空气相色谱法检测了其中的有机溶剂残留量，对于挥发性物质的研究可参考采用此法。浸提样品与浸提方式的选择是相辅相成的23。浸提样品优先选择最终产品，或根据代表性部分的浸提结果推算出整个样品的结果。若终产品无法满足浸提要求，可采用相同原材料在相同工艺条件下加工成的半成品来完成浸提；若含有多种材料，选取的样品中每一组分占样品的比例需要与此组分占被测产品的比例相同。表1动物源医疗器械可沥滤物相关标准序号123456789101112标准编号YY/T 1465.5-2016YY/T 0771.1-2020YY/T 0771.2-2020YY/T 0771.3-2009YY/T 0771.4-2015YY 0970-2013YY/T 0606.25-2014YY/T 1561-2017YY/T 1788-2021GB/T 16886.17-2005GB/T 16886.16-2021YY/T 1550.2-2019标准名称医疗器械免疫原性评价方法 第5部分：用M86抗体测定动物源医疗器械中-Gal抗原清除率动物源医疗器械 第1部分：风险管理应用动物源医疗器械 第2部分：来源、收集与处置的控制动物源医疗器械 第3部分：病毒和传播性海绵状脑病(TSE)因子去除与灭活的确认动物源医疗器械 第4部分：传播性海绵状脑病(TSE)因子的去除和/或灭活及其过程确认分析的原则含动物源材料的一次性使用医疗器械的灭菌液体/灭菌剂灭菌的确认与常规控制组织工程医疗产品 第25部分：动物源生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法组织工程医疗器械产品动物源支架材料残留-Gal抗原检测外科植入物 动物源补片类产品通用要求医疗器械生物学评价 第17部分：可沥滤物允许限量的建立医疗器械生物学评价 第16部分：降解产物与可沥滤物毒代动力学研究设计一次性使用输液器具与药物相容性研究指南 第2部分：可沥滤物研究已知物综述癌变畸变突变2 2 6CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.3May 20233.2浸提介质的选择对于某些临床使用中仅接触单一液体体系的产品，可采用该临床接触液体作为浸提介质，对于无法模拟的介质，或者当已知可沥滤物易与介质发生反应从而造成干扰时，可选择替代溶剂。其中，在水能溶解的情况下，以水做溶剂可以更好地模拟材料植入人体情况。替代溶剂应根据可沥滤物特征进行选择，且不应与待测物发生化学反应，同时应考虑器械在临床接触介质的性质等，除此之外，材料本身的性能也应被考虑。如因生物补片与SDS结合的化学键比较牢固，使得难以检出全部的SDS残留，若用氢氧化钠或硫酸降解生物补片则会使SDS发生不可逆的化学变化，所以亚甲基蓝法不能直接用于检测 SDS残留。而碳酸钠可以竞争性地与生物补片中的蛋白质结合，从而能够使SDS游离出来，同时甲醇产生的界面聚集能够加速游离12，因此可采用甲醇-碳酸钠混合液作为浸提介质。3.3浸提条件的选择浸提体积的选择在保证浸提液能够完全浸没样品的基础上尽量减少，同时也需防止被浸提物质因浓度过大而饱和。此外可根据样品面积或质量比例加入浸提液进行浸提，如脱细胞异种皮肤