单细胞转录组学技术在肢体再生研究中的应用_尹福玲.pdf

（Biomedical Transformation），2023年6月，第4卷，第2期单细胞转录组学技术在肢体再生研究中的应用尹福玲，林梓杰，王亚宁，张宏波*收稿日期：2023-04-15；修回日期：2023-05-16基金项目：广东省自然科学基金面上项目（2021A1515012065）；科技部国家重点研发计划项目（2019YFA0801703；2022YFA1104904）通信作者：张宏波（1984-），男，湖南衡阳人，教授，主要从事干细胞代谢和衰老相关研究。E-mail:【摘要】蝾螈具有极强的肢体再生能力，爪蟾在发育过程中再生能力则逐渐下降，而人类和其它哺乳动物的成年个体没有肢体再生能力。借助单细胞转录组学技术可以分析细胞转录水平的优势，以蝾螈、爪蟾等肢体可再生的动物为模型，近年研究已发现并鉴定了一系列调控肢体再生的关键基因、信号通路和细胞类群，提示再生能力存在潜在的进化保守机制。单细胞转录组学技术在跨物种研究中的应用，使得免疫细胞、成纤维细胞类型和能量代谢机制对再生的重要影响得到进一步挖掘，再生组织细胞来源和异质性得以进一步明确，为解释再生相关机制奠定理论依据。单细胞多组学技术的发展和应用将有望为进一步研究有效提升哺乳动物再生能力指明方向。【关键词】单细胞转录组学；肢体再生；肢芽；胚芽中图分类号：R339.3+7文献标识码：A文章编号：2096-8965（2023）02-0022-09Single-cell transcriptomics technology and its applicationin limb regeneration researchYin Fuling,Lin Zijie,Wang Yaning,Zhang Hongbo*(Key Laboratory for Stem Cells and Tissue Engineering,Ministry of Education,Zhongshan School of Medicine,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,Guangdong,China;Advanced Medical Technology Center,The First Affiliated Hospital,Zhongshan School of Medicine,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,Guangdong,China)【Abstract】Salamanders have a strong ability to regenerate limbs,while this potential is progressivelydeclined in frogs during development.With evolution,adults of humans and other mammals completely lose theability to regenerate limbs.With the advantages of single-cell transcriptomics in analyzing cellular transcription,anumber of key genes,cell populations and signaling pathways regulating limb regeneration have been identifiedusing salamanders and frogs as research models in recent years.This suggest that there are potential evolutionaryconserved regulatory mechanisms for limb regeneration.With the help of single-cell transcriptomics,cross-speciesstudies have allowed the important roles of immune cells,fibroblasts and energy metabolism on regeneration to befurther explored.Together with advances in confirming the regeneration origination and cell heterogeneity,thecurrent studies using single-cell techniques have provided the theoretical basis for understanding regeneration-related mechanisms.The development and application of single-cell multi-omics technologies could hopefullyfigure out the way for further research to effectively enhance the regenerative capacity of mammals.【Keywords】Single-cell transcriptomics;Limb regeneration;Limb bud;Blastema（中山大学中山医学院，干细胞与组织工程教育部重点实验室，广东 广州 510080；中山大学中山医学院-附属第一医院先进医学技术研究中心，广东 广州 510080）DOI：10.12287/j.issn.2096-8965.2023020322（Biomedical Transformation），2023年6月，第4卷，第2期动物界中存在广泛的再生现象：无脊椎动物水螅残体碎片可快速再生为完整个体1-3，脊椎动物中鱼纲的斑马鱼可以再生鳍4，5，爬行动物壁虎断尾6及两栖纲蝾螈断肢均可再生7，但同为两栖动物的爪蟾的再生能力随生长发育而下降，进化至哺乳动物后肢体和器官的再生能力基本丢失。人类儿童期尚可以再生截断的手指尖端，而在成年后这种再生能力完全丧失。肢体再生的一般模式也得到更细致的描述，即肢端受损后伤口表面首先形成表皮，随后表皮下方形成胚芽组织，胚芽组织中细胞受到环境因素的调节，经增殖、分化和迁移，重新形成肢体或不完全再生8，9。肢体再生现象与进化过程中再生能力的逐渐丧失原因及机理长期以来是生命科学和基础医学的研究热点。肢体再生不仅是揭示复杂细胞命运决定机理的理想模型，而且其深入研究对再生医学的发展具有决定性意义。肢体损伤、缺失作为常见遗传缺陷和事故中的高发疾病，可引发人们对肢体再生的直接需求。此外，多种常见疾病如糖尿病、血管疾病也容易导致肢体损伤10，11，却一直没能找到完美的治疗方法，造成全球残疾人口规模庞大。肢体缺失造成的失能问题也导致患者个人生活质量下降和社会生产力的下降，进而增加社会总体负担12，13。因而，肢体再生研究不仅具有重要的理论价值，也具有解决肢体损伤再生的现实医学难题、提高患者生活水平、减轻因疾病带来的家庭和社会负担的现实意义。1单细胞转录组学技术的发展现况转录组是指细胞或组织在某一特定发育阶段或功能状态下其基因组转录出来的所有RNA的集合，具有作为蛋白质合成模板、指导蛋白质合成的功能。转录组对解码基因组结构和功能、鉴定生命活动背后的基因表达变化、探索基因与蛋白质之间的联系等有着重要作用。转录组学技术已经广泛应用于生物学、医学等领域，如在生物学中分析不同物种转录组差异，在分子水平上探索物种进化规律，在医学中用于研究病原微生物致病机制及其与宿主之间的相互作用等。传统的转录组学分析是对大量混合细胞转录组进行研究（Bulk Transcriptome）。然而受单细胞分离纯化技术、单细胞可获取RNA总量及扩增技术局限，传统的混合细胞转录组学仅能对组织水平的总体基因表达进行分析，无法研究细胞水平的异质性，造成信息丢失、分辨精度下降。自2009年首个高通量单细胞RNA测序方法提出以来14，单细胞转录组测序（Single-cell transcriptome）技术不断发 展，并 衍 生 出 多 种 相 关 单 细 胞 技 术，如Chromium、Smart-Seq、CEL-Seq、Drop-Seq、inDrop等。其中常用的Smart-Seq技术通过逆转录、预扩增等手段，提高cDNA产量和长度，提高了检测的覆盖率和精确度15；CEL-Seq技术通过扩增前对样本进行编码和混合，克服了单样本掩盖潜在微量表达 RNA 的问题，实现了对复杂组织的分析16；Drop-Seq技术可对大量细胞同时分析，实现了转录组学分析的提速，扩大了应用的范围17。独立于上述技术之外的单细胞染色体可及性检测技术scATAC-Seq可以在不检测RNA水平的条件下通过检测染色体的开放程度，从表观遗传水平研究基因的潜在转录倾向性18。随着技术不断进步，转录组学技术在近些年得到了广泛的应用，在肢体再生的研究领域取得了诸多进展。本论文简述单细胞转录组学的进展及其在肢体再生研究中的应用，重点讨论近年来借助单细胞组学技术发现的若干与肢体再生相关的关键机制，并从进化的角度分析哺乳动物肢体再生能力丧失的可能原因。2单细胞转录组学技术在肢体再生中的应用成果2.1 进化背景下肢体再生的潜在机制蝾螈等四足动物肢体在肌肉、骨骼和手指的发育模式已被观察到与肺鱼等肉翅目鱼类相似19，基于二者的亲缘关系，该发现提示其或存在相似的再生特征。的确，通过单细胞转录组学技术对比两者的再生早期胚芽与未损伤组织，并进行差异基因功能富集分析，研究发现两者具有相似的再生模式。例如，两者再生胚芽中均上调的基因有 Mmp11、Sall4、Msx2、Wnt5a、Fgf8 和 Fgf10，均下调的基因有Mybpc2、Casq1、Myoz1、Smpx和Tnnt34等。针对特定基因的研究发现，Msx1、Fgf10、Runx1基因在非洲爪蟾20、蝾螈8，21、肉翅目鱼类4再生过程中呈现类似的时空表达模式。不同的是，Dio3和Runx1基因在小鼠和肉翅目鱼类虽然均在再生期间上调4，但呈现相反的空间分布22，即在小鼠和肉翅目鱼类再生第 9天观察到 Dio3主要表达于远端，而Runx1主要表达于近端。上述发现说明四足动物与肉翅目鱼类的再生能力存在遗传调控模式的相似性。在小鼠指尖再生胚芽中Sox9或Sp7标记的骨骼前体细胞群体主要分化为骨与骨膜细胞，VE-23（Biomedical Transformation），2023年6月，第4卷，第2期cadherin或Tie2标记的细胞主要分化为血管内皮细胞23，24，提示哺乳动物指尖再生中基因表达可能存在细胞类型特异性。借助单细胞转录组，研究进一步发现Mest广泛表达于胚芽，提示Mest可能是再生特异性的标志基因25。对哺乳动物如人类和小鼠相同差异表达基因在肢体再生不同时期的分布、功能差异等的进一步研究，或可解释不同物种再生能力的差异。2.2 再生过程中幼态持续具有重要作用蝾螈存在幼态持续（Neoteny）现象，这主要是因为其下丘脑垂体甲状腺轴功能低下，促甲状腺激素的释放受损且失去活性，导致成熟障碍26。此外，断肢再生时，编码催化甲状腺激素失活酶的Dio3基因表达量上调4，提示幼态持续在蝾螈的再生中可能存在重要的作用。有研究为探究成熟进程对蝾螈再生的影响，通过外源性补充甲状腺激素的方式使其达到最成熟的状态，发现成熟状态的蝾螈再生能力明显下降，并出现增殖速度减弱以及再生畸形27。进一步单细胞转录组学分析发现，幼态持续蝾螈再生组织中主要富集表达基因为Gata4、Gata6和Pdgfra，功能富集于发育，而成熟后蝾螈高表达的基因是Wnt信号激活因子Caprin2和环境应激激活因子Ppm1d67，功能富集于肌肉结构的发