抗坏血酸_过氧化氢介导乳清...白与EGCG接枝聚合动力学_熊厚盛.pdf

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.6 53 抗坏血酸/过氧化氢介导乳清分离蛋白 与 EGCG 接枝聚合动力学 熊厚盛，陈立莹，解新安，李雁，李璐*（华南农业大学食品学院，广东广州 510642）摘要：以抗坏血酸（Ascorbic Acid，Asc）和过氧化氢（Hydrogen Peroxide，H2O2）为引发剂，研究乳清分离蛋白（Whey Isolate Protein，WPI）与表没食子儿茶素没食子酸酯（(-)-Epigallocatechin Gallate，EGCG）接枝聚合动力学。系统研究活化时间、引发剂浓度、单体浓度和温度对接枝量的影响，通过测定反应级数和表观活化能，建立接枝反应动力学方程。结果表明，在 Asc/H2O2体系中，由抗坏血酸自由基（Asc-）介导 WPI 与 EGCG 接枝反应。当反应条件为Asc 浓度0.014 mol/L，H2O2浓度0.10 mol/L，溶液pH 值6，温度 308.15 K 以及活化时间 120 min 时，接枝量为 42.08 mg/g。基于上述结果，我们可以得到在 Asc 浓度0.010.022 mol/L，H2O2浓度0.090.12 mol/L，EGCG 浓度0.001 20.004 2 mol/L，温度 298.15308.15 K 变化范围内，建立了 WPI 接枝EGCG 的聚合速率方程，聚合反应的表观活化能 E=12.96 kJ/mol。研究结果为蛋白质的结构设计和可控制备提供理论指导，拓宽蛋白质在食品工业中的应用。关键词：抗坏血酸；过氧化氢；乳清分离蛋白；表没食子儿茶素没食子酸酯；聚合动力学 文章编号：1673-9078(2023)06-53-60 DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2023.6.0821 Kinetics of Ascorbic Acid/Hydrogen Peroxide-mediated Graft Polymerization of Whey Protein Isolate with EGCG XIONG Housheng,CHEN Liying,XIE Xinan,LI Yan,LI Lu*(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)Abstract:Graft polymerization of(-)-epigallocatechin gallate(EGCG)onto whey protein isolate(WPI)was investigated using ascorbic acid(Asc)and hydrogen peroxide(H2O2)as a redox system.The effects of different reaction parameters on the graft yield;activation time,initiator concentration,monomer concentration,and temperature were determined,and the kinetic equation for the graft polymerization reaction was established from the reaction level and apparent activation energy.The results demonstrated that,in an Asc/H2O2 system,acid free radicals(Asc-)mediate the graft polymerization of WPI and EGCG,with the graft yield reaching 42.08 mg/g under an ascorbic acid concentration of 0.014 mol/L,H2O2 concentration of 0.10 mol/L,pH value 6,temperature of 35,and activation time of 120 min.Based on the above results,a calculation equation describing the WPI-EGCG polymerization rate was obtained for reactions under an Asc concentration range of 0.01 0.022 mol/L,H2O2 concentration range of 0.090.12 mol/L,EGCG concentration of 0.001 20.004 2 mol/L,and temperature of 298.15 308.15 K.An activation energy of 12.96 kJ/mol was obtained for polymerization.The results provide theoretical guidance for the structural design and controllable preparation of proteins,thus broadening the application of proteins in the food industry.Key words:ascorbic acid;hydrogen peroxide;whey protein isolate;(-)-epigallocatechin gallate;polymerization kinetics 引文格式：熊厚盛,陈立莹,解新安,等.抗坏血酸/过氧化氢介导乳清分离蛋白与 EGCG 接枝聚合动力学J.现代食品科技,2023,39(6):53-60.XIONG Housheng,CHEN Liying,XIE Xinan,et al.Kinetics of ascorbic acid/hydrogen peroxide-mediated graft polymerization of whey protein isolate with EGCG J.Modern Food Science and Technology,2023,39(6):53-60.收稿日期：2022-06-28 基金项目：国家自然科学基金项目（31501471）作者简介：熊厚盛（1997-），男，硕士研究生，研究方向：纳米乳液研究，E-mail： 通讯作者：李璐（1978-），女，博士，副教授，研究方向：食品功能载运体系构建与应用，E-mail：lulu_ 乳清分离蛋白（Whey Isolate Protein，WPI）是牛奶在 pH 值为 4.6 下沉淀出酪蛋白后得到的蛋白混合物，主要组分有-乳白蛋白、-乳球蛋白、免疫球蛋白以及牛血清白蛋白1。WPI 不仅具有良好的溶解性，乳化性等功能特性，还可以作为天然的递送系统保护易被人体消化降解的活性物质2。多酚可以与蛋白质现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.6 54 共价结合，赋予蛋白强抗氧化性，从而拓宽蛋白质在食品中的应用。目前，已经有碱法、酶法和自由基诱导法三种接枝方法合成蛋白质-多酚复合物。和传统的酶法及碱法接枝相比，自由基接枝可在常温下引发，具有安全快速、避免多酚降解的优点，但接枝效率较 低3。表没食子儿茶素没食子酸酯（(-)-Epigallocatechin Gallate，EGCG）是从绿茶中提取的一种多酚类物质，具有很强的抗氧化活性4。相比于其他多酚物质，EGCG 与 WPI 结合后表现出更好的乳化性、抗氧化性和热稳定性5-7。已有大量文献报道使用抗坏血酸（Ascorbic Acid，Asc）和过氧化氢（Hydrogen Peroxide，H2O2）作为引发剂将多酚与蛋白进行自由基接枝聚合8-10。根据自由基接枝机理，首先是 Asc 和 H2O2引发产生自由基，其次自由基攻击蛋白使之活化，最后活化蛋白再与多酚结合形成接枝物11。然而，目前研究人员对Asc/H2O2引发的自由基种类说法不一，Wu 等12报道了Asc/H2O2协同超声降解壳聚糖的作用机制。超声波的存在促进Asc/H2O2分解产生羟基自由基（OH），大量的OH 破坏了壳聚糖的-1,4 糖苷键，使壳聚糖迅速降解为短寡聚体。Daniel 等13研究了 Asc/H2O2介导的菊粉-球蛋白接枝的机制。结果显示，OH 和抗坏血酸自由基（Asc-）从菊粉的甲基中提取一个氢原子，得到菊粉大自由基，没食子酸分子通过共价键的方式接枝到这些位置，形成聚合物。这些结果表明，对于 Asc/H2O2体系产生的自由基种类还需进一步明确。在自由基接枝过程中涉及自由基聚合动力学，这是一种研究反应速率与单体浓度、引发剂浓度和温度之间定量关系的方法，通过分析动力学特征及建立聚合速率方程，进而深入探索聚合过程，揭示接枝机制，目前已在乙烯乙酸、甲基丙烯酸等物质的接枝聚合反应研究中得到广泛应用14,15。但对于 WPI 接枝多酚的改性研究，还主要集中在针对接枝物结构分析以及应用性能的提高上3,16-18，有关 WPI 接枝 EGCG 等多酚聚合反应的动力学研究仍鲜见报道。本文通过电子顺磁共振波谱仪（Electron Paramagnetic Resonance，EPR）明确 Asc 和 H2O2产生的自由基，以 EGCG 为单体，通过接枝共聚反应制备了 WPI-EGCG 接枝聚合物，系统研究活化时间、引发剂浓度、EGCG 单体浓度、反应温度以及 pH 等因素对接枝量的影响，以优化接枝条件；进而考察接枝速率随引发剂浓度、EGCG 单体浓度、反应温度的变化规律，据此建立接枝反应动力学方程，为WPI 接枝 EGCG 反应过程及机理研究提供理论 基础。1 材料和方法 1.1 试剂和仪器 乳清分离蛋白、5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）广州市齐湘生物技术有限公司；抗坏血酸、过氧化氢、乙二胺四乙酸（EDTA）、氢氧化钠、无水碳酸钠广州化学试剂厂；表没食子儿茶素没食子酸酯上海源叶生物科技有限责任公司。BK-FD18BS 真空冷冻干燥机济南欧莱博科学仪器有限公司；UV-2500 紫外可见分光光度计德国斯派克分析仪器公司；Bruker EMXplus-10/12 电子顺磁共振波谱仪德国布鲁克公司。1.2 实验方法 1.2.1 Asc/H2O2体系中自由基鉴定 通过 EPR 对 Asc/H2O2引发体系中产生的自由基进行定性分析。在 49 mL 水溶液中加入 0.25 g Asc 和0.01 mol/L 的 H2O2溶液，混匀后取 1 mL 加入 10 L 100 mmol/L DMPO 溶液，对其产生的自由基进行检测。EPR 的检测条件如下：微波频率 9.44 GHz；扫场宽度 100 G；调频 100 kHz；调幅 1.00 G。微波功率12 mW，磁场 3 4603 560，调制幅度2 500 G，扫描时间 64 s，积累 3。EPR 谱图中最强信号的整体高度可看作自由基信号的相对强度19。自由基的类型是由特征峰和 g 值来确定的，g 值的计算公式如下：hvgB B （1）式中：h普朗克常数，6.62610-34 Js；v频率，Hz；B玻尔磁子，9.27410-28 J/G；B中心磁场，Gauss。1.2.2 WPI 与 EGCG 接枝物的制备 根据 Spizzirri 等20的方法制备 WPI-EGCG 接枝物。称取0.5 g WPI 溶解于 49 mL 的去离子水中，充分溶解后加入 1 mL H2O2溶液和 A