蒺藜苜蓿MtbHLH148转录因子的克隆与转化及其功能分析.pdf

西北植物学报,():A c t aB o tB o r e a l O c c i d e n tS i nd o i:/j i s s n h t t p:/x b z w x b a l l j o u r n a l n e t收稿日期:;修改稿收到日期:基金项目:中国农业科学院科技创新工程(A S T I P I A S );国家牧草产业技术体系(C A R S )作者简介:王菊萍(),女,在读硕士研究生,主要从事牧草遗传育种研究.E m a i l:q q c o m通信作者:康俊梅,副研究员,主要从事牧草遗传育种的研究.E m a i l:K a n g j u n m e i c a a s c n蒺藜苜蓿M t b H L H 转录因子的克隆与转化及其功能分析王菊萍,王珍,张铁军,龙瑞才,杨青川,康俊梅(中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所,北京 )摘要:b HLH(B a s i ch e l i x l o o p h e l i x,b HLH)转录因子家族是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物生长发育和盐胁迫应答机制.该研究利用同源克隆的方法克隆蒺藜苜蓿(M e d i c a g o t r u n c a t u l a)的M t b HLH 基因,采用q R T P C R方法分析M t b HLH 基因在蒺藜苜蓿中的表达特性,构建超表达载体并通过农杆菌侵染法转化拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a),对转基因拟南芥的耐盐性相关功能进行分析研究.结果显示:()从蒺藜苜蓿中获得M t b HLH 基因,该基因c D NA全长 b p,包含开放阅读框为 b p,编码 个氨基酸,蛋白分子量 k D,等电点为 ;蛋白结构分析显示,该蛋白无跨膜结构域,无信号肽,为亲水性蛋白;含有精氨酸/赖氨酸残基的保守 结 构 域 和 典 型 的b HLH结 构 域;二 级 结 构 以 螺 旋 和 无 规 则 卷 曲 为 主.()亚 细 胞 定 位 表 明,M t b HLH 蛋白定位在细胞核.()进化树分析表明,M t b HLH 与大豆(G l y c i n em a x)的亲缘性最近;启动子分析发现,该基因启动子区域含有光响应元件、MY B结合位点以及A B A应答元件A B R E,可能参与非生物胁迫.()q R T P C R分析发现,M t b HLH 基因在蒺藜苜蓿的茎中表达量最高,叶中表达量最低,且M t b HLH 基因受A B A(m o l/L)诱导并在盐胁迫(mm o l/LN a C l)处理h内表达量上调,而在低温()处理时表达量明显下调.()成功构建超表达载体p C AMB I A M t b HLH 并转化拟南芥获得 个抗性株系,经鉴定有 个过表达株系,其中表达量最高的转基因株系为O E;对O E 株系耐盐性功能分析发现,转基因拟南芥植株的发芽率明显高于野生型,盐胁迫下转基因拟南芥的根长是野生型的 倍,表明其耐盐性得到了增强.研究表明,M t b HLH 基因可能在盐胁迫调节机制中具有一定的调控作用.关键词:蒺藜苜蓿;转录因子;盐胁迫中图分类号:Q ;Q 文献标志码:AC l o n i n ga n dA n a l y s i so faB a s i cH e l i x l o o p h e l i x(b H L H)T r a n s c r i p t i o nF a c t o rM t b H L H f r o mM e d i c a g o t r u n c a t u l aLWANGJ u p i n g,WANGZ h e n,Z HANGT i e j u n,L ONGR u i c a i,YANGQ i n g c h u a n,KANGJ u n m e i(I n s t i t u t eo fA n i m a lS c i e n c e so fC h i n e s eA c a d e m yo fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s,B e i j i n g ,C h i n a)A b s t r a c t:T h eb HLHt r a n s c r i p t i o nf a c t o r f a m i l y,o n eo f t h e l a r g e s t t r a n s c r i p t i o nf a c t o r f a m i l i e s i np l a n t s,h a sb e e nr e p o r t e dt o i n v o l v e i np l a n tg r o w t ha n ds a l ts t r e s sr e s p o n s e I nt h i ss t u d y,h o m o l o g o u sc l o n i n gw a su s e dt oa c q u i r e t h eM t b HLH g e n e f r o mb a r r e l c l o v e r(M e d i c a g o t r u n c a t u l a)q R T P C Rw a su s e dt oa n a l y z et h ee x p r e s s i o np a t t e r no fM t b HLH g e n ei nb a r r e lc l o v e r T h eo v e r e x p r e s s i o nv e c t o rw a sc o n s t r u c t e da n d t r a n s f o r m e d i n t oA r a b i d o p s i st h r o u g ha g r o b a c t e r i u mi n f e c t i o n,s oa s t oa n a l y z e t h e r e l a t e df u n c t i o n so fs a l tt o l e r a n c e o ft r a n s g e n i cA r a b i d o p s i sT h er e s u l ts h o w s:()t h ef u l ll e n g t h o fM t b HLH c D NA w a s b p,Wh i c hc o n t a i n e d b po p e nr e a d i n gf r a m ea n de n c o d i n g a m i n oa c i d s T h e t h e o r e t i c a lp Io fM t b HLH p r o t e i nw a s a n dw h o e sm o l e c u l a rw e i g h tw a s k DP r o t e i ns t r u c t u r ea n a l y s i ss h o w e dt h a t t h ep r o t e i nh a dn o t r a n s m e m b r a n ed o m a i n,n os i g n a l p e p t i d ea n d i tw a sah y d r o p h i l i cp r o t e i n T h i sg e n ec o n t a i n e dh i g h l yc o n s e r v e db HLHd o m a i n s A se x p e c t e d,t h es e c o n d a r ys t r u c t u r ew a sp r e d o m i n a t l y h e l i xa n dr a n d o mc u r l()S u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o nr e s u l t ss h o w e dt h a t t h ep r o t e i n sw e r el o c a t ei nt h en u c l e u s()P h y l o g e n e t i ca n a l y s i sr e v e a l e dt h a tM t b HLH w a sc l o s e l yr e l a t e dt oG l y c i n em a xA n a l y s i so f t h ec i s r e g u l a t o r ye l e m e n td e m o n s t r a t e dt h a t t h ep r o m o t e r so fM t b HLH c o n t a i n e d l i g h t,h o r m o n ea n ds t r e s sr e s p o n s ee l e m e n t s,s u g g e s t i n gt h e i r i n v o l v e m e n t i nt h eb i o l o g i c a l p r o c e s s e s()q R T P C Ra n a l y s i so f t h ee x p r e s s i o np a t t e r no f t h eM t b HLH i nb a r r e l c l o v e rs h o w e dt h a t t h eh i g h e s t l e v e l i ns t e ma n dt h e l o w e s t l e v e l i nl e a f F o r t r e a t m e n t,t h eg e n e sw e r e i n d u c e db yA B A(m o l/L),a n dw e r e r e p r e s s e db yc o l d()b u t u p r e g u l a t e db yN a C l(mm o l/L)w i t h i nt h e f i r s t h()T h ep C AMB I A M t b HLH o v e r e x p r e s s i o nv e c t o rw a s s u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e di n t oA r a b i d o p s i sW eo b t a i n e d r e s i s t a n tl i n e sa n di d e n t i f i e d o v e r e x p r e s s e dl i n e s Am o n gt h e s eo v e r e x p r e s s e d l i n e s,t h et r a n s g e n i c l i n eO E h a dt h eh i g h e s te x p r e s s i o nl e v e l A n a l y s i so fs a l t t o l e r a n c e f u n c t i o no fO E s h o w e dt h a t as i g n i f i c a n t l yh i g h e rg e r m i n a t i o nr a t ew a so b s e r v e d i ns p i t eo ft h e i r i n d i s c e r n i b l ep h e n o t y p i cd i f f e r e