雷公藤甲素对小鼠生精功能的损伤作用及机制的研究_郭建强.pdf

世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.实验研究：基金项目：国家自然科学基金面上项目（）作者单位：北京中医药大学研究生院，北京；中日友好医院男科，北京；中日友好医院病理科，北京；北京中医药大学第三附属医院，北京；中日友好医院检验科，北京；北京协和医学院基础学院，北京；中日友好医院临床研究所，北京 通信作者：刘保兴，：雷公藤甲素对小鼠生精功能的损伤作用及机制的研究郭建强，鲍丙豪，宋爱平 张秀平 张铁 柯正浩 潘振坤 王菲 邓婷婷黄浩男 刘保兴【摘要】目的 观察雷公藤甲素（，）连续给药小鼠整个生精周期（）对睾丸组织的损伤效应、产生损伤的量效关系及与氧化应激机制之间的联系。方法将 只雄性 小鼠分为正常组及雷公藤甲素不同剂量组（组；组；组；组；组），每组各 只。根据分组分别以 溶液及 不同剂量组溶液连续灌胃 周。计算睾丸脏器指数、观察病理结果及生精细胞凋亡情况，检测睾丸组织的活性氧（）及氧化酶（、）抗氧化酶（、）表达水平。结果 与正常组比较，组睾丸脏器指数下降；部分生精小管出现损伤（生精细胞排列紊乱、间隙增加、精子减少等）；凋亡细胞数增加；及氧化酶（、）表达水平上升，差异无统计学意义（）；抗氧化酶（、）活性下降，差异无统计学意义（）。与 组比较，组 组睾丸脏器指数随着剂量增加而下降，其中 组较正常组，差异有统计学意义（）；组 组生精功能损伤随着给药剂量增加逐渐加重，其中 组及 组管腔内未见生精细胞、仅存在支持细胞；组凋亡细胞增加，组 组因各级生精细胞大量丢失，凋亡细胞反而较少（其中 组较 组凋亡细胞减少，组、组几乎无凋亡细胞存在）；组 组 及氧化酶（、）表达水平呈上升趋势，差异无统计学意义（）；抗氧化酶（、）活性呈下降趋势，差异无统计学意义（）。结论在小鼠整个生精周期（）内，给药建立生精功能损伤模型的最合适剂量为 （），这种损伤与氧化应激引起的细胞凋亡相关。【关键词】雷公藤甲素；小鼠；生精功能损伤；氧化应激【中图分类号】【文献标识码】，（，；，；，；，；，；，；，）【】（）（），（，），世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.，（）（）（，），（，），（）（），（，）（），（，），（；）（）（），（，）（）（）（）【】；雷公藤（）是一种传统中草药，临床可用于治疗炎症和自身免疫类疾病，如类风湿关节炎、肾小球肾炎、自身免疫性肝病等。其提取物 雷公藤甲素（，）被认为是雷公藤的主要活性成分之一。近年来的研究表明：具有抗炎、免疫调节、抑制肿瘤生长等药理作用。在发挥治疗作用的同时，的毒副作用也较为明显：主要表现为对生殖系统、肝脏、肾脏等的损伤，其中，生殖系统毒性尤为明显。因此，越来越多地作为药物被应用于诱导雄性动物不育模型。研究表明 引起的损伤可能由细胞凋亡、氧化损伤、线粒体损伤等机制实现。对于睾丸而言，可能通过氧化应激使睾丸内部氧化与抗氧化系统失衡，增加氧化产物，进而损伤睾丸组织。目前，对于 给药建立小鼠生精功能损伤模型的最佳剂量和时间仍未得到统一。已有研究评估了 不同剂量给药 、（给药 次）或 （给药 次）等时间段 对睾丸生精功能的损伤作用，以不同剂量给药 小鼠整个生精周期（）对于睾丸生精功能损伤的研究有待进一步明确。本研究拟评估 连续灌胃 对睾丸组织的损伤效应及产生损伤的量效关系及作用机制。材料与方法 材 料 动 物 只雄性 小鼠，体质量 ，周龄，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物生产许可证：京 ，动物合格证：。所有小鼠均可自由获取食物和水。饲养环境无病原体、温度相对恒定（），相对湿度在 之间，并进行 光照 黑暗的循环（开灯，关灯）。化学品和试剂雷公藤甲素（中国食品药品检定研究院，批号：）；细胞凋亡检测试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：）；酶联试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：）；、试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为：、）。仪 器 光学显微镜（）；酶标仪（）。方 法 造模与取材将 只小鼠随机分为 组：（）正常组；（）组；（）组；（）组；（）组；（）组。除正常组外，其余组分别于每日 点灌胃 次相应浓度的雷公藤甲素溶液（溶液配制方法：将雷公藤甲素 溶 于 溶 液 中，分 别 配 制 、溶液），正常组于同时间段灌胃等浓度的 溶液，其余时间各组小鼠可自由饮食。世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.持续灌胃 后，称重，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉处死，称量睾丸质量，计算脏器指数。将左侧睾丸分离进行固定，进行后续病理、凋亡染色。取出右侧新鲜睾丸组织，保存，用于 及氧化指标检测。睾丸组织病理学分析中性甲醛溶液固定睾丸组织 后，石蜡包埋，切成厚度约 的切片。应用苏木素 伊红（，）染色后，在 光学显微镜下观察睾丸组织的病理变化（）。睾丸 染色睾丸组织切片进行脱蜡、水合，按照 试剂盒的说明进行标记染色。在 光学显微镜下获取图像（）。睾丸组织氧化 抗氧化酶含量测定新鲜睾丸组织从 冰箱中取出，加入生理盐水进行研磨制备睾丸组织匀浆液并收集；根据试剂盒说明书的方法采用 酶标仪测定睾丸组织匀浆液中、的含量水平。统计学方法采用 检验检测睾丸指数和活性氧、氧化酶 抗氧化酶数据是否呈正态分布，各组中的变量均呈正态分布以均数 标准差（）表示，若呈非正态分布使用（，）表示。符合正态分布的数据进一步使用 检验进行方差齐性检验，符合正态分布及方差齐性检验的数据进行单因素方差分析（）处理，并用最小显著性差异（）检验评估组间差异的显著性，不满足正态分布或满足正态分布但方差不齐的数据则使用非参数检验处理，并用 检验评估组间差异的显著性。所有统计分析均使用 （，）软件进行。以 为差异有统计学意义。结 果 对睾丸脏器指数的影响与正常组比较，组小鼠睾丸脏器指 数（睾 丸 重 量 体 重，）降 低；与 组比较，给药各组睾丸脏器指数随用药剂量增加而逐渐下降，其中 组、组以及 组睾丸脏器指数明显下降，差异有统计学意义（，）。结果见表。表 各组小鼠睾丸脏器指数水平比较（）组 别剂量（）睾丸指数（）正常组 值 值 注：与正常组比较，对小鼠生精功能的影响正常组生精小管形态正常，生精上皮可见各级生精细胞排列有序，管腔内可见正常精子细胞；组形态基本正常，部分小管生精细胞排列紊 乱、间 隙 增 加，管 腔 内 精 子 细 胞 减 少；组管腔缩小，各级生精细胞排列紊乱、间隙增 加，出 现 空 泡，部 分 生 精 细 胞 脱 失；组管腔缩小、大量生精细胞脱失，出现大量空腔，仅少数小管存在生精细胞；组及 组管腔内未见明显生精细胞、仅存在支持细胞。表明小鼠的生精功能损伤随着 给药剂量的增加而加重。结果见图。注：表示生精小管，表示生精小管内空泡，表示处于紊乱状态的生精小管图 不同剂量 对小鼠生精功能的影响（染色，）世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.对睾丸组织细胞凋亡的影响与正常组比较，组 组凋亡细胞增多，且 组凋亡细胞多于 组；组 组生精小管萎缩，大量生精细胞脱失，可观察到的凋亡细胞反而较少。结果见图。注：表示生精小管图 不同剂量 对睾丸组织细胞凋亡的影响（染色，）对小鼠睾丸组织 水平的影响与正常组比较，组 水平有升高趋势，但差异无统计学意义（）；与 组比较，其余剂量组（、）水平也仅有升高趋势，差异无统计学意义（）；同时与正常组比较，其余剂量组（、）水平仅有升高趋势，差异无统计学意义（）。结果见表。表 各组小鼠睾丸组织 水平比较（，）组 别剂量（）（）正常组（，）（，）（，）（，）（，）（，）值 值 对小鼠睾丸组织氧化酶 抗氧化酶活性的影响与正常组比较，组氧化酶（）表达水平上升，其余剂量组（、）氧化酶（）表达水平较 组有上升趋势，组抗氧化酶（、）表达水平下降，其余剂量组（、）抗氧化酶（、）表达水平较 组有下降趋势，但差异无统计学意义（）；同时与正常组比较，其余剂 量 组（、）氧化酶（）表达水平呈上升趋势、抗氧化酶（、）表达水平呈下降趋势，但差异无统计学意义（）。结果见表。讨 论 是雷公藤提取物中生物活性较强的物质，也被认为是引起毒副作用的主要成分。既往实验明确了 对小鼠的生精功能具有损伤作用，可引起睾丸组织内氧化 抗氧化系统失衡，使得 水平增加，出现氧化应激，进而导致睾丸生精小管结构表 各组小鼠睾丸组织氧化 抗氧化酶表达水平比较组 别剂量（）（，），（，）（，），（，），（，）正常组（，）（，）（，）（，）（，）（，）（，）（，）（，）（，）（，）（，）（，）（，）（，）（，）（，）（，）值 值 值 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.紊乱，生精细胞凋亡，生精功能减退，。研究显示：以 （）的剂量连续灌胃 可有效降低雄性布氏田鼠的繁殖活性；以 （）的剂量连续灌胃 可对小鼠睾丸产生轻度至重度的毒性（使生精细胞变性、精母细胞数量减少）；以 （）的剂量给药（腹腔注射）共 可损伤昆明小鼠生精功能（使睾丸脏器系数下降、睾丸萎缩、生精细胞变性）。但仍缺乏针对整个生精周期（）内给药 损伤睾丸生精功能的量效关系评估。因此本研究观察了以不同剂量连续给药 对小鼠生精功能的损伤作用。通过比较产生损伤的量效关系探究整个生精周期内给药 损伤小鼠生精功能的合适剂量，并探究 通过氧化应激途径产生的损伤效应与给药剂量之间的联系，为今后 灌胃给药建立小鼠生精功能损伤模型提供依据。既往研究表明 可降低睾丸重量，破坏睾丸的组织结构：使生精细胞丢失、生殖细胞间隙增加、生精小管受损。这与我们的实验结果是一致的：不同剂量组睾丸重量随着给药剂量增加而下降、并出现了不同程度的生精细胞脱失、管内细胞间隙增加、细胞排列紊乱。内给药（次）对小鼠生精功能的损伤结果显示：给药 是使睾丸损伤量效关系明显较为合适的时间点，而 （）、（）是较为合适的剂量：可使单个生精细胞轻微变性或轻度的单个生精细胞坏死、生精小管萎缩、生精上皮变性。内给药（次）对小鼠生精功能的损伤效果显示：的剂量可使几乎所有的生精小管内各级生精细胞和精子均减少或消失，仅残留少数精原细胞和支持细胞，并推测 对生精功能的毒性可能是一种蓄积作用。本研究给药 后睾丸组织病理结果表明：给药 （）损伤效果显著：可使生精小管管腔缩小、各级生精细胞排列紊乱、间隙增加，出现空泡等情况；而给药 （）及以上剂量会对小鼠的生精功能产生严重损伤（生精小管内大量生精细胞丢失、仅存在支持细胞）。这与给药 的研究相比在剂量相近情况下由于灌胃周期更长、毒性蓄积作用更为显著，因此损伤效果更加显著：组就可观察到生精小管萎缩、细胞排列紊乱等情况，而同 内每 给药 次的研究结论相近。这提示我们就整个生精周期而言：（）是建立小鼠生精功能损伤模型最为合适的剂量。先前的研究在明确 对睾丸组织损伤的前提下，观察 给药组 染色图像中存在较对照组偏多的阳性细胞，。本研究通过 染色在 组中观察到了较正常组偏多的凋亡细胞，且 组凋亡细胞多于 组。但可能同上述研究结论相似，给药引起的细胞凋亡主要出现在给药前期（周），加之用药剂量偏大，到 时，组 组各级生精细胞大量丢失，如 组、组仅存在支持细胞，故在 组可观察到的凋亡细胞较 组减少，组、组难以观察到凋亡细胞。有关给药 对睾丸组织造成损伤的可能机制较多，其中氧化应激可能是重要原因之一。研究显示 可诱导 显著增加，的增加会促使氧化应激反应的出现，与许多疾病有着密切联系，过量的 可导致组织氧化损伤，进而诱发心力衰竭、肝肾毒性，等疾病的出现，是反映机体氧化损伤的重要指标，也是氧化 抗氧化失衡的结果。过量的 会增加组织内氧化酶（、）水平，并降低其抗氧化酶（、）活性。先前的研究显示，给药后睾丸组织内出现严重的氧化损伤：水平升高且 活性下降。本研究证实了这一观点：给药后小鼠睾丸组织 含量增加，、表达水平呈升高趋势且、活性呈下降趋势，这表明睾丸组织内出现了氧化 抗氧化系统的失衡。而 水平升高引起的氧化应激可进一步导致组织细胞凋亡。给药对睾丸组织的损伤作用与氧化应激相关性的研究证实了上述指标如氧化酶（）抗氧化酶（）等数值的显著性差异。本研究也观察到了这种差异，但该差异无统计学意义，仅表明随着 给药剂量增加而出现、表达水平升高以及、活性下降的趋势。这可能由以下原因引起：（）与氧