聚合酶链反应-序列特异性引...其与氯吡格雷抵抗相关性研究_刘丽平.pdf

基金项目：江苏省干部保健科研项目（）；江苏省科技项目（）第一作者：刘丽平（），女，江苏宿迁人，主管检验师通信作者：梁 伟，：.短篇论著聚合酶链反应序列特异性引物法检测宿迁地区汉族人群 基因多态性及其与氯吡格雷抵抗相关性研究刘丽平，陈素梅，刘东声，朱 青，梁 伟.徐州医科大学，江苏 徐州；.徐州医科大学附属宿迁医院 检验科，江苏 宿迁；.连云港市赣榆区人民医院 检验科，江苏 连云港；.徐州医科大学连云港临床学院 检验科，江苏 连云港 摘要目的建立一种可以快速检测细胞色素氧化酶 基因多态性的检测方法，并调查宿迁地区汉族人群、和 等位基因分布频率及与氯吡格雷抵抗的相关性。方法 选取 年 月在徐州医科大学附属宿迁医院神经内科住院治疗且诊断为初发急性脑卒中的 例患者设为脑卒中组；另选取同期于本院体检中心进行健康体检且无血缘关系的 例健康体检者设为健康组。检测两组研究对象的 基因多态性，并应用血栓弹力图仪检测脑卒中组氯吡格雷抑制率，探究、位点多态性与氯吡格雷抵抗的相关性。结果 本研究自主设计并建立一种实验室方法，可有效检测 多态性，随机挑选部分标本，采用引物对（）、（）、（）进行聚合酶链反应，产物直接测序，与聚合酶链反应序列特异性引物法检测结果对比，完全一致。宿迁地区汉族健康组与脑卒中组的 基因多态性均表现为：慢代谢型（，）、中间代谢型（，）、快代谢型（）及超快代谢型（）。脑卒中组中，携带 个功能缺失等位基因患者的频率明显高于健康组，差异有统计学意义（.）。携带两个功能缺失等位基因氯吡格雷抵抗发生率高于氯吡格雷敏感，差异有统计学意义（.）。结论聚合酶链反应序列特异性引物法可用于 基因型的快速检测，明确了宿迁地区汉族人群的 基因型情况，证实慢代谢型患者基因型与氯吡格雷抵抗的发生存在相关性。关键词 基因；氯吡格雷抵抗；单特异性引物聚合酶链反应；血栓弹力图检测中图分类号：.：文章编号：（）脑卒中为多种原因所致脑组织缺血、缺氧病变，进而产生对应的神经损伤表现。氯吡格雷是脑卒中后最常用的抗血小板药物之一，在卒中和短暂性脑缺血发作患者卒中预防指南中常被推荐作为缺血性卒中的一级治疗和二级预防。氯吡格雷属于前体药物，在肝中通过 酶代谢后产生可以选择性抑制 与 受体相结合产物，从而对血小板聚集有抑制作用。酶由 基因编码组成，其基因存在显著的遗传多态性和种族分布差异。有研究报道，等位基因中的、及基因均对氯吡格雷代谢产生一定的影响。是由于 基因侧翼序列 端 位点 突变，增加 的转录水平，进而可以增加 蛋白产物。有研究报道，携带 等位基因纯合子与杂合 子 的 出 血 风 险 分 别 是 未 携 带 者 的.倍 和.倍。基因型携带者会促进氯吡格雷活性代谢物的产生、增强血小板聚集抑制效果、提高出血风险及降低缺血事件风险等方面存在一定的相关性。根据 基因、位点基因型，可将 酶分为 类：慢代谢型（，）、中间代谢型（，）、快代谢型（）及超快代谢型（，）。分析 基因多态性可推断其代谢表型，进而可预测药物代谢能力及药物疗效，指导临床合理用药。本研究基于等位基因特异性原理，建立快速检测 基因多态性的方法，探索特异性检测最佳反应条件，并运用所建立方法对健康人群和脑卒中人群 基因多态性等位基因的分布频率进行初步分析，探究等位基因分布与氯吡格雷抵抗的相关性。现报道如下。资料与方法.一般资料 选取 年 月在徐州医科大学附属宿迁医院神经内科住院治疗且诊断为初发急性脑卒中的 例患者设为脑卒中组，其中，男性 例，女性 例；平均年龄（.）岁。纳入标准：年龄 岁；汉族；籍贯为宿迁；明确诊断为急性脑卒中，以中国急性缺血性脑卒中诊治指南 为诊断依据。另选取同期于本院体检中心进行健康体检且无血缘关系的 例健康体检者设为 临床军医杂志 年 月 第 卷 第 期 ，.，.，健康组，其中，男性 例，女性 例；平均年龄（.）岁。纳入标准：无慢性病；汉族；籍贯为宿迁；经过一般体检，排除其他慢性疾病；标本采集前 周内未服用药物。两组研究对象一般资料比较，差异无统计学意义（.），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准。所有研究对象均对本研究知情同意。.基因组 提取分别采集两组研究对象的外周抗凝血液，采用 提取试剂盒（天根生化科技公司），参照说明书操作，提取基因组，经核酸浓度检测仪测定其浓度及纯度后，冻存备用。.单特异性引物设计参照 中的 基因序列，利用 .软件设计引物。根据 位点等位基因不同，在引物的 设计一对等位基因特异性扩增引物，达到只能特异性扩增目标碱基而不扩增其他碱基的目的。在引物 末端倒数第二位或倒数第三位甚至倒数第四位引入错配碱基（表），以增加引物的特异性。同时设计了一对内对照引物（，），以排除因聚合酶链反应（，）体系中某成分漏加，造成假阴性结果。.聚合酶链反应序列特异性引物反应体系及退火表 单特异性引物列表名称引物序列（）引物长度 退火温度 产物长度 温度的选择 反应体系：包含 预混液，正向）、（，）各 ，模板 ，剩余体积以双蒸水补足。反应条件设定为：预变性 ，变性 ，退火 ，每对引物设置 个反应管，退火温度分别为延伸，个循环后，产物 保存。反应产物经 琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像仪观察结果，选择无非特异扩增条带且特异性扩增条带最亮的反应管，对应的退火温度为后续反应的退火温度。.构建重组质粒 切下大小正确的 产物条带，用胶回收试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）纯化回收 产物，将纯化的 产物连接至 载体，得到重组质粒，经测序验证带有目的片段的重组质粒分别命名为：，；，；，。用上述得到的重组质粒模拟不同基因型：，模拟 纯合子；，模拟 纯合子；、以 混合模拟 杂合子。同理可得 ，；，等基因型的纯合子和杂合子。.聚合酶链反应序列特异性引物扩增准确性验证探究聚合酶链反应序列特异性引物（，）敏感性及抗干扰性后并应用 法对健康组与脑卒中组进行 扩增，随机按比例挑选 纯合子和杂合子用测序引物扩增后（），对 产物进行基因测序，经测序验证结果与 法检测结果完全一致。.统计学方法 采用 .统计学软件对数据进行处理。符合正态分布的计量资料用均数 标准差（?）表示，组间比较采用 检验。计数资料用例（百分率）表示，组间比较采用 检验。以 .为差异有统计学意义。结果.反应退火温度的确定温度梯度 反应产物经琼脂糖凝胶电泳结果显示，在 范围内均可扩增出特异性条带，且在 时条带最亮，为获得较高分辨率，后续选择 为最佳退火温度，以确保特异性 的准确性。临床军医杂志 年 月 第 卷 第 期 ，.，.，.检测 基因型 用质粒模拟 个 位点的各种基因型，经 反应后，各基因型均可准确分辨。对健康组和脑卒中组 样本 反应，每个标本采用一对单特异性反向引物与共同正向引物平行扩增，每个反应孔中均可见 的内对照 产物，特异性引物扩增产物分别为 、。.敏感性及干扰性探究 单特异性引物聚合酶链反应引物敏感性及抗干扰性能对反应至关重要，本研究中 基因 个 位点的单特异性扩增引物敏感度分别 为：，；，；，；，；，；，。.测序验证随机挑选部分标本，采用引物对（）、（）、（）进行，产物直接测序，与 法检测结果对比，完全一致。见图。.江苏宿迁地区汉族人群 基因多态性分布 采用单特异性引物对健康组和脑卒中组样本 进行 反应。对野生型基因中携带 个功能缺失的等位基因、携带 个功能缺失的等位基因，以及携带功能增强等位基因频率进行比较，结果显示，脑卒中组中，携带 个功能缺失等位基因患者的频率明显高于健康组，差异有统计学意义（.）。见表。例脑卒中患者存在氯吡格雷抵抗的患者 例，氯吡格雷敏感 例；其中，未携带功能缺失等位基因 例，发生氯吡格雷抵抗 例（.）；携带一个功能缺失等位基因 例，发生氯吡格雷抵抗 例（.）；携带两个功能缺失等位基因 例，发生氯吡格雷抵抗 例（.）。携带两个功能缺失等位基因氯吡格雷抵抗发生率高于氯吡格雷敏感，差异有统计学意义（.）。见表。图 基因测序结果表 宿迁地区汉族健康组与脑卒中组基因频率比较 例（百分率）组别基因型，健康组（）（.）（.）（.）脑卒中组（）（.）（.）（.）值.表 脑卒中组氯吡格雷不同代谢情况的 基因频率比较 例（百分率）氯吡格雷代谢情况基因型，氯吡格雷抵抗（）（.）（.）（.）氯吡格雷敏感（）（.）（.）（.）值.临床军医杂志 年 月 第 卷 第 期 ，.，.，讨论 卒中后常规使用抗血小板药物治疗，并使用氯吡格雷药物治疗，可显著降低急性卒中患者复发的风险，是预防急性卒中后再梗死的重要治疗方法。细胞色素（）酶系在抗血小板药物氯吡格雷代谢中占有极其重要的地位。（美芬妥英羟化酶）是 酶系中占主导地位的酶之一，其遗传多态性对临床药物的代谢产生一定的影响，且由于该酶活性的个体差异较大，造成不同个体的药物不良反应及药物治疗效率产生较为严重的影响。氯吡格雷在常规剂量下治疗慢代谢型患者时，会使其活性代谢物及抑制血小板聚集作用降低，提高了血栓形成的风险；而在超快代谢型患者中产生活性代谢产物增加，抑制血小板聚集作用增强，出血风险相对增加。因此，年美国食品及药物管理局修改了黑框警告：基因型结果可作为医师治疗策略调整的参考。氯吡格雷是一种前体药物，其自身不具有活性，但经过小肠吸收后约 的药物前体经过酯酶水解作用变成了无活性物质，其他约 的前体药物会通过肝生成的代谢产物具有活性。氯吡格雷作为 受体拮抗剂之一，可以结合血小板膜表面 受体，并能阻碍血小板膜糖蛋白与纤维蛋白原的结合，从而产生血小板聚集抑制的现象。但在临床中，部分患者应用标准剂量的氯吡格雷后，并不能取得预期的抑制血小板聚集效果，被称为氯吡格雷抵抗或血小板高反应性。对氯吡格雷药效产生影响的因素除了患者年龄、性别、药物相互作用、吸烟与否、糖尿病及高血脂等因素外，的基因多态性具有重要的作用。有研究报道，基因上已有超过 个 位点，而大部分位点在亚洲人群中出现的频率。基于 基因的 位点在亚洲人群中的分布情况，本研究选择对、以及（野生型）进行检测。近年来研究发现，酶活性差异与其基因多态性密切相关，基因型与表型间有良好的一致性。基因检测较蛋白活性测定具有操作简便且结果稳定的优势，但同时具有检测成本高昂、耗时长等缺点。本研究旨在建立快速、灵敏且经济实惠的检测方法（），引物设计和退火温度选择是该检测方法的关键环节，法检测 基因 位点多态性是基于引物 末端碱基与模板互补，引入倒数第二或倒数第三甚至倒数第四位碱基错配，增加引物与模板结合不稳定性，进而提高检测特异性。本研究共纳入 例健康者与 例脑卒中患者，运用 法检测并分析 基因多态性，发现脑卒中患者中，同时携带 个功能缺失等位基因（、）的频率显著高于健康组，其原因可能是动脉粥样硬化为脑卒中发病的常见病因，而血小板聚集学说是众多阐述动脉粥样硬化的发病机制学说之一。经血栓弹力图检测，发生氯吡格雷抵抗患者共 例，其中，携带两个功能缺失等位基因的患者 例，携带两个功能缺失等位基因患者氯吡格雷抵抗发生率为.（）；未携带功能缺失等位基因的患者中也有 例存在氯吡格雷抵抗现象，说明氯吡格雷抵抗现象的发生不仅与患者自身基因型相关，还可能与其服用的药物、基础疾病或接受其他治疗手段等因素相关。此外，由于个体用药后存在明显差异，依临床治疗时的常规剂量用药，可能会致使部分患者出现过高的血药浓度而发生中毒现象，或出现过低的血药浓度而无法起到治疗的效果。因此，可通过基因检测确定患者的基因类型，依基因多态性结果用药，及时调整药物的剂量或品种，个体化用药，进而提高治疗效果、降低不良反应发生率。综上所述，法可用于 基因型的快速检测，明确宿迁地区汉族人群的 基因型情况，证实慢代谢型（，）患者基因型与氯吡格雷抵抗的发生存在相关性。参考文献：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，：，（）：钟 迪，张舒婷，吴波 中国急性缺血性脑卒中诊治指南解读 中国现代神经疾病杂志，（）：，（）：（下转第 页）临床军医杂志 年 月 第 卷 第 期 ，.，.，：，（）：，（）：，（）：（），（）：廖 恺，郑荣辉，陶昊昀，等 多西他赛、顺铂及替吉奥方案诱导化疗序贯同期放化疗治疗局部晚期鼻咽癌的回顾性分